核糖核酸酶Onconase制备过程优化研究

作     者：郭红 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐殿胜

授予年度：2013年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：癌症 Onconase 复性 分离纯化 

摘      要：豹蛙酶(Onconase,简称ONC)是一种从北极豹蛙卵母细胞和早期胚胎中提取的核糖核酸酶,属于RNase A超家族,研究证实其对许多肿瘤细胞和实体肿瘤都具有杀伤作用。 以一株表达豹蛙酶的基因工程菌为研究对象,分别在摇瓶和3.7L小型发酵罐中对工程菌发酵工艺进行了优化,确定了接种量2%、IPTG浓度0.5mM、诱导时间3.5小时,菌体内豹蛙酶表达量占胞内蛋白总量的30%以上。 进一步对豹蛙酶的纯化工艺进行探索,建立了菌体破碎、包涵体洗涤、蛋白复性、蛋白纯化工艺。文章中采用的复性方法主要是稀释复性。为得到最优的复性条件,本实验对不同复性温度研究,结果表明当复性温度在4℃时,复性效果最优;对复性缓冲液中盐类(主要是精氨酸和尿素的选择)研究,结果表明当复性缓冲液中加入0.5M的精氨酸时,复性效果最优;对复性缓冲液中尿素浓度研究,结果表明当复性缓冲液中加入尿素浓度为2M时,复性效果最优;对GSSG加入复性缓冲液的时间研究,结果表明在2M尿素体系下,包涵体加入缓冲液之前加入GSSG复性效果最优。对四种蛋白质复性体系研究(包括尿素浓度为2M,尿素浓度1.5M,包含精氨酸,酸沉法所用),结果表明各个复性体系均可使得豹蛙酶电泳纯度达到90%以上,精氨酸体系所得到的蛋白的回收率达到30%以上。