转录激活因子3促进肝纤维化的机制研究

作     者：李冠彤 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩涛

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肝纤维化 转录激活因子3 肝星状细胞 Smad3 TGF-β 

摘      要：目的肝纤维化的主要特征是细胞外基质(ECM)的过度累积,活化的肝星状细胞(HSCs)是ECM的主要来源。但是,肝纤维化所涉及的确切靶分子尚不清楚。本研究旨在通过构建四氯化碳(CCl)诱导的肝纤维化小鼠模型筛选出在小鼠肝纤维化组织中显著差异表达的m RNAs,从中选择转录激活因子3(ATF3)。拟进一步验证其与肝纤维化发生发展的相关性,阐明其在肝纤维化中的功能以及作用机制,为肝纤维化的治疗提供新的靶点。方法首先构建CCl诱导的肝纤维化小鼠模型,然后进行高通量芯片分析,从中筛选出一个在肝纤维化组织中显著过表达的m RNA,ATF3。其次分别在CCl和胆管结扎(BDL)诱导的肝纤维化模型小鼠的肝组织中以及肝纤维化患者的肝组织标本中,检测ATF3的表达;在正常小鼠和肝纤维化模型小鼠的原代肝星状细胞(HSCs)中,在体外培养激活的原代HSCs中,在TGF-β处理的人肝星状细胞系LX-2和正常小鼠原代HSCs中,检测ATF3的表达;在TGF-β处理的小鼠肝细胞系AML-12和正常小鼠原代肝细胞(HCs)中,通过q RT-PCR和Western blot检测ATF3表达水平。进一步实验探究ATF3在肝纤维化过程中的作用,通过鼠尾静脉注射以慢病毒为载体的sh RNA沉默ATF3后检测其对肝纤维化以及增殖、凋亡和炎症相关基因的影响;提取小鼠的原代HSCs,检测ATF3对HSCs激活的影响;提取小鼠的原代HCs,检测ATF3对肝细胞增殖、凋亡和炎症的影响。此外进行ATF3体外功能实验:在原代HCs、AML12细胞中沉默和过表达ATF3,检测ATF3对肝细胞中炎症基因、增殖基因以及凋亡相关基因表达的影响;在原代HSCs和LX-2细胞中沉默和过表达ATF3,检测促纤维化基因的表达。最后进行ATF3的机制研究,运用染色质免疫沉淀(Ch IP)技术检测Smad3在ATF3启动子区域结合情况;在LX-2细胞中沉默Smad3后再用TGF-β处理,检测ATF3的表达量;通过激光共聚焦显微技术(Confocal)以及核浆分离技术检测激活的肝星状细胞中ATF3的表达和定位变化;运用Ch IP技术检测ATF3在促纤维化基因启动子区域的结合变化,免疫共沉淀(co-IP)实验检测ATF3免疫沉淀复合物变化,验证ATF3是否与Smad3形成复合物,从而调节促纤维化基因的转录。结果本研究通过基因芯片技术筛选出在肝纤维化组织中过表达的ATF3。通过实验证实ATF3在肝纤维化小鼠以及肝纤维化患者的肝组织中过表达;在肝纤维化小鼠的原代HSCs和原代HCs内过表达;在体外培养激活的正常小鼠原代HSCs中以及用TGF-β处理的LX-2细胞、正常小鼠原代HSCs、原代HCs和AML12细胞中,ATF3的表达也显著升高。而在体内沉默ATF3可抑制CCl诱导的小鼠肝纤维化,并且抑制HSCs的激活,但不影响肝细胞的凋亡和增殖。在体外实验中,ATF3不仅促进LX-2细胞以及小鼠原代HSCs的激活也促进肝纤维化相关基因的表达。机制实验证实ATF3主要定位于细胞核,与Smad3形成复合物并在靶基因的启动子区结合增多。结论在这项研究中,我们报道了ATF3在小鼠和人类肝纤维化的肝脏中以及活化的HSCs和受损的HCs中均过表达。通过体内和体外研究证明了沉默ATF3可降低促纤维化基因的表达并抑制HSCs的活化,从而减轻肝纤维化的程度。同时也证实ATF3不影响肝细胞的凋亡或增殖。机制实验证实TGF-β信号通过Smad3引起ATF3过表达,并且ATF3主要定位于细胞核,可以与Smad3形成复合体,并在促纤维化基因的启动子区域结合增多,从而促进促纤维化基因转录。全文揭示了ATF3在肝纤维化过程中发挥重要作用,可以为肝纤维化的治疗提供新的靶点。