人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

作     者：李姝萍 

作者单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所 

学位级别：硕士

导师姓名：张洪涛

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：人PD-L1杂交瘤 人源化 PD-L1检测 慢病毒载体 EGFR×PD-L1双修饰CAR 膜表达型 分泌表达型 合成生物技术 

摘      要：目的:制备一种抗人程序性死亡配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab),并对其进行人源化,使之适用于临床检测和治疗研究;基于人源化PD-L1抗体,构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)特异性嵌合抗原受体和PD-L1抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:(1)采用杂交瘤技术获得PD-L1抗体。重组人PD-L1胞外区-Fc融合蛋白常规腹部免疫5只BALB/c小鼠,每只3次,测定效价,取2只高效价鼠,冲击免疫后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用PD-L1-his通过包被蛋白间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性克隆,小鼠腹腔注射杂交瘤制备腹水,经饱和硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析纯化抗体,冻干备用。Western blot分析PD-L1抗体与PD-L1表达载体转染293T细胞的结合情况,流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)和竞争ELISA检测PD-L1抗体对PD-1与PD-L1结合的阻断作用,ELISA分析m Ab类别,Fortebio Octet96测定亲和力,选择高分泌株进一步亚克隆,建立稳定系,通过ELISA进一步检测小型化PD-L1-sc Fv与PD-L1蛋白的结合活性。(2)采用互补决定区(complementarity-determining regions,CDRs)移植法,对鼠抗体人源化。抗体全长测序,获取鼠源PD-L1抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDR序列,与免疫遗传学数据库(IMGT)比对分析,选择与鼠抗体序列相似度最高人源化抗体框架区(framework region,FR),将鼠CDR区植入人源化抗体FR,亲本抗体的CDRs嫁接到人受体载体中以获得每种亲本抗体的5个人源化轻链和5个人源化重链,在HEK293T细胞中表达了25个人源化抗体,以在不同浓度下进行亲和力测定,并进行抗体亲和力排序。选择亲和力排序前3种纯化的抗体,最后,纯化与嵌合抗体具有相似结合亲和力的人源化抗体(VH+VL),鉴定人源化抗体的特性。(3)EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达。人EGFR m Ab杂交瘤,5’RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建sc Fv,克隆至真核载体pc DNA3.1进行表达鉴定。基因合成EGFR特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR,引入CD137协同信号胞内功能域)与人源化PD-L1-sc Fv借助2A序列连接,克隆入慢病毒p LVX-EF1a-IRES-Zs Green1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots(VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞上清PD-L1-sc Fv表达。同法将上述目的基因克隆入慢病毒GV401表达载体,制备慢病毒,其中膜表达型慢病毒(KL46407-1)感染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:(1)经过反复克隆,从初选的10株杂交瘤中,筛选出1株单克隆抗体(11E3),能够与PD-L1蛋白高亲和力结合,亚类为Ig G2a,亲和力K值为1.66×10mol/L,具备高度配受体封阻性能;(2)11E3经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10mol/L);(3)EGFR-sc Fv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率均为10%。对应慢病毒CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-sc Fv,检测培养上清存在PD-L1-sc Fv;慢病毒CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-sc Fv和PD-L1-sc Fv有效表达。膜双表达型慢病毒(KL46407-1)感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论:获得一组鼠抗人PD-L1杂交瘤,从中筛选到一株与人PD-L1蛋白具有高亲和力抗体,具有高度配受体封阻性能,潜在的应用于肿瘤PD-L1表型检测和抗PD-1治疗有效性评估;成功构建EGFR-CAR和PD-L1-sc Fv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰