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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第3期40卷 198-205页

作者：李姝萍王小珏杨斌王和林闫卓红易玲韦攀健金鑫郝建清张洪涛北京市结核病胸部肿瘤研究所中心实验室 101149 首都医科大学附属北京胸科医院肿瘤免疫室 101149 新乡医学院第一附属医院肿瘤内科 453100

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶... 详细信息

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

关键词： EGFR-CAR PD-L1-scFv 膜表达型分泌表达型合成生物技术

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人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

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作者：李姝萍北京市结核病胸部肿瘤研究所

学位级别：硕士

目的:制备一种抗人程序性死亡配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab),并对其进行人源化,使之适用于临床检测和治疗研究;基于人源化PD-L1抗体,构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体(epidermal growth... 详细信息

目的:制备一种抗人程序性死亡配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab),并对其进行人源化,使之适用于临床检测和治疗研究;基于人源化PD-L1抗体,构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)特异性嵌合抗原受体和PD-L1抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:(1)采用杂交瘤技术获得PD-L1抗体。重组人PD-L1胞外区-Fc融合蛋白常规腹部免疫5只BALB/c小鼠,每只3次,测定效价,取2只高效价鼠,冲击免疫后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用PD-L1-his通过包被蛋白间接酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性克隆,小鼠腹腔注射杂交瘤制备腹水,经饱和硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析纯化抗体,冻干备用。Western blot分析PD-L1抗体与PD-L1表达载体转染293T细胞的结合情况,流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)和竞争ELISA检测PD-L1抗体对PD-1与PD-L1结合的阻断作用,ELISA分析m Ab类别,Fortebio Octet96测定亲和力,选择高分泌株进一步亚克隆,建立稳定系,通过ELISA进一步检测小型化PD-L1-sc Fv与PD-L1蛋白的结合活性。(2)采用互补决定区(complementarity-determining regions,CDRs)移植法,对鼠抗体人源化。抗体全长测序,获取鼠源PD-L1抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的CDR序列,与免疫遗传学数据库(IMGT)比对分析,选择与鼠抗体序列相似度最高人源化抗体框架区(framework region,FR),将鼠CDR区植入人源化抗体FR,亲本抗体的CDRs嫁接到人受体载体中以获得每种亲本抗体的5个人源化轻链和5个人源化重链,在HEK293T细胞中表达了25个人源化抗体,以在不同浓度下进行亲和力测定,并进行抗体亲和力排序。选择亲和力排序前3种纯化的抗体,最后,纯化与嵌合抗体具有相似结合亲和力的人源化抗体(VH+VL),鉴定人源化抗体的特性。(3)EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达。人EGFR m Ab杂交瘤,5’RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL、VH)基因,构建sc Fv,克隆至真核载体pc DNA3.1进行表达鉴定。基因合成EGFR特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR,引入CD137协同信号胞内功能域)与人源化PD-L1-sc Fv借助2A序列连接,克隆入慢病毒p LVX-EF1a-IRES-Zs Green1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots(VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞上清PD-L1-sc Fv表达。同法将上述目的基因克隆入慢病毒GV401表达载体,制备慢病毒,其中膜表达型慢病毒(KL46407-1)感染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:(1)经过反复克隆,从初选的10株杂交瘤中,筛选出1株单克隆抗体(11E3),能够与PD-L1蛋白高亲和力结合,亚类为Ig G2a,亲和力K值为1.66×10mol/L,具备高度配受体封阻性能;(2)11E3经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10mol/L);(3)EGFR-sc Fv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率均为10%。对应慢病毒CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-sc Fv,检测培养上清存在PD-L1-sc Fv;慢病毒CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-sc Fv和PD-L1-sc Fv有效表达。膜双表达型慢病毒(KL46407-1)感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论:获得一组鼠抗人PD-L1杂交瘤,从中筛选到一株与人PD-L1蛋白具有高亲和力抗体,具有高度配受体封阻性能,潜在的应用于肿瘤PD-L1表型检测和抗PD-1治疗有效性评估;成功构建EGFR-CAR和PD-L1-sc Fv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰

关键词：人PD-L1杂交瘤人源化 PD-L1检测慢病毒载体 EGFR×PD-L1双修饰CAR 膜表达型分泌表达型合成生物技术

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EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

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结核病与胸部肿瘤 2020年第2期 87-94页

作者：李姝萍 ﹐王小珏 ﹐杨斌 ﹐王和林 ﹐闫卓红易玲 ﹐韦攀健﹐金鑫郝建清张洪涛北京市结核病胸部肿瘤研究所中心实验室 101149 首都医科大学附属北京胸科医院肿瘤免疫室 101149

目的构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联... 详细信息

目的构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆人慢病毒pLVX-EF1.-RES-ZsGreen1表达载体,使用Lent-X Packagng Singie Shots(VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1l-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10^-10 molL),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTCO537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-SeFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

关键词： EGFR-CAR PD-LI-scFv 膜表达型分泌表达型合成生物技术

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