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慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

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生物化学与生物物理进展 2007年第2期34卷 215-221页

作者：杨志峰王龙杨生生匡颖陈欢徐国江蔡在龙王铸钢毛积芳第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室上海200433 上海市南方模式生物研究中心上海201203

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创... 详细信息

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.

关键词： IKKα基因慢病毒载体 RNA干扰转基因小鼠

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慢病毒载体感染成年食蟹猴骨髓间充质干细胞

生物工程学报 2010年第6期26卷 789-795页

作者：任振华王淑艳张颖邹春林张愚首都医科大学宣武医院细胞治疗中心北京100053 安徽医科大学人体解剖学教研室合肥230032

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有增殖和多向分化潜能,临床应用广泛,近年来备受关注。另一方面,MSCs易于转导和表达外源基因,是理想的基因工程细胞。非人灵长类(NHPs)和人类具有非常相近的遗传背景,NHPs模型在评价药... 详细信息

骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有增殖和多向分化潜能,临床应用广泛,近年来备受关注。另一方面,MSCs易于转导和表达外源基因,是理想的基因工程细胞。非人灵长类(NHPs)和人类具有非常相近的遗传背景,NHPs模型在评价药物疗效和移植治疗等方面具有不可替代的价值。本研究采用密度梯度离心法分离成年食蟹猴骨髓单核细胞(Marrow mononuclear cells,MNCs),贴壁培养MSCs。同时构建表达绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体,感染成年食蟹猴MSCs。结果显示,体外培养的成年食蟹猴MSCs均感染猴泡沫病毒(Simian foamy virus,SFV),体外培养成年食蟹猴MSCs必须添加抗病毒药物Tenofovir。但由于食蟹猴MSCs感染SFV,以及培养中添加了抗病毒药物Tenofovir,慢病毒载体的感染效率明显降低(病毒药,在细胞复苏后6d转染慢病毒,可大幅提高慢病毒的感染效率(>50%)。为成年食蟹猴MSCs作为基因工程细胞应用于实验和临床研究提供了技术保证。

关键词：食蟹猴骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白慢病毒载体猴泡沫病毒转导

慢病毒载体介导基因治疗阿尔茨海默症和帕金森症研究进展

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生物工程学报 2020年第12期36卷 2707-2718页

作者：许德润刘力郎明林中国科学院大学生命科学学院生物互作卓越创新中心北京100049 中国科学院生物物理研究所脑与认知国家重点实验室北京100101

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)与帕金森症(Parkinson’s disease,PD)是人类常见的神经退行性疾病。AD与PD发病机制复杂,目前的药物和外科手术治疗无法缓解或阻止疾病进程。慢病毒载体(Lentiviral vector,LV)是一种逆转录病毒载... 详细信息

阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)与帕金森症(Parkinson’s disease,PD)是人类常见的神经退行性疾病。AD与PD发病机制复杂,目前的药物和外科手术治疗无法缓解或阻止疾病进程。慢病毒载体(Lentiviral vector,LV)是一种逆转录病毒载体,由LV介导的基因治疗已成为当前疾病机制研究、临床药物开发等领域的研究热点。文中综述了近年来LV应用于AD、PD治疗的研究进展,并对今后的应用研究前景进行了展望。

关键词：阿尔茨海默症帕金森症慢病毒载体基因治疗

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慢病毒载体定量检测方法的研究进展

生物工程学报 2021年第7期37卷 2283-2292页

作者：陈思琪张松平杨延丽李贺平王歈刘幽燕广西大学化学化工学院广西南宁530000 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室北京100190 北京永泰瑞科生物科技有限公司北京100176

免疫疗法正在发展成为一种可用于多种恶性肿瘤的有效且侵入性较小的治疗方法。慢病毒载体(Lentiviral vectors,LVs)因其能够稳定地整合相对较大的外源DNA,并且有效地转导分裂细胞和非分裂细胞,已在免疫治疗中显现出巨大潜力。临床应用... 详细信息

免疫疗法正在发展成为一种可用于多种恶性肿瘤的有效且侵入性较小的治疗方法。慢病毒载体(Lentiviral vectors,LVs)因其能够稳定地整合相对较大的外源DNA,并且有效地转导分裂细胞和非分裂细胞,已在免疫治疗中显现出巨大潜力。临床应用对慢病毒载体具有较高的质量要求,需要对最终产品进行严格的质量控制以保证其纯度、效力和安全性。其中慢病毒载体的定量检测是产品研发和质控的关键环节之一。文中总结了LVs定量检测的现有方法,包括流式细胞术(Fluorescence activated cell sorter,FACS)、P24酶联免疫法(P24 enzyme-linked immunosorbent assay,P24 ELISA)、实时荧光定量PCR方法 (Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、纳米粒子跟踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)、可调电阻式脉冲传感(Tunable resistive pulse sensing,TRPS)和病毒计数仪(Virus counter,VC),并对其优缺点进行比较,对发展新的检测方法和存在的挑战进行了展望。

关键词：慢病毒载体定量感染性滴度颗粒分析

慢病毒载体介导的CXCR4基因过表达骨髓间充质干细胞在防治小鼠移植物抗宿主病中的作用

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中华血液学杂志 2014年第10期35卷 936-940页

作者：陈伟李淼张翠萍王祥民潘彬曾令宇李振宇徐开林徐州医学院附属医院血液科 221002

目的探讨小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因过表达的骨髓间充质干细胞（MSC）防治小鼠移植物抗宿主病（GVHD）作用.方法利用慢病毒载体构建过表达小鼠CXCR4基因的重组慢病毒载体,包装病毒后转导小鼠骨髓间充质干细胞（CXCR4-MSC）.... 详细信息

目的探讨小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因过表达的骨髓间充质干细胞（MSC）防治小鼠移植物抗宿主病（GVHD）作用.方法利用慢病毒载体构建过表达小鼠CXCR4基因的重组慢病毒载体,包装病毒后转导小鼠骨髓间充质干细胞（CXCR4-MSC）.以C57BL/6小鼠为供鼠,BALB/c小鼠为受鼠,建立小鼠异基因骨髓移植（BMT）模型,同时输注骨髓MSC.分5组：全身照射（TBI）组：仅接受TBI; BMT组：TBI组输注小鼠骨髓细胞;GVHD组：BMT组输注异基因脾细胞;EGFP-MSC组：GVHD组输注EGFP-MSC; CXCR4组：GVHD组输注CXCR4-MSC.观察受鼠生存状态,统计生存率,观察受鼠组织病理学改变及炎症细胞因子变化,评价其对GVHD防治作用.结果 TBI组小鼠在照射后14d内均死于造血衰竭,BMT组受鼠可获长期存活,GVHD组、EGFP-MSC组和CXCR4-MSC组生存时间分别为（1 7.0±2.3）、（21.7±4.8）、（30.1±9.1）d,CXCR4-MSC共移植组受鼠存活时间明显长于GVHD组（P＜0.05）.各组受鼠均出现腹泻、弓背、翘毛、皮肤缺损、体重减轻等GVHD症状,共移植CXCR4-MSC组受鼠临床评分低于GVHD组（P＜0.05）.GVHD组与EGFP-MSC组受鼠肝脏、小肠与皮肤均存在典型GVHD病理改变,CXCR4-MSC组仅发生Ⅰ～Ⅱ度病理改变,受鼠组织病理评分低于以上两组.移植后第14天,各组受鼠促炎症因子水平明显升高,CXCR4-MSC组IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明显低于GVHD组与EGFP-MSC组（P＜0.05）.结论联合输注CXCR4过表达的骨髓MSC可通过降低受鼠移植后炎症因子分泌从而减轻GVHD.

关键词：慢病毒载体骨髓移植移植物抗宿主病间质干细胞 CXCR4基因

慢病毒载体介导SHIP基因抑制K562细胞增殖及对PI3K/Akt信号通路的调控

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癌症 2009年第4期28卷 366-372页

作者：杨琳罗建民刘小军温树鹏杜行严姚丽河北医科大学第二医院血液科河北石家庄050000

背景与目的:SHIP基因主要表达于造血细胞,通过降解PIP3抑制PI3K/Akt信号通路而在造血细胞增殖和存活中起重要负调控作用。本研究通过慢病毒载体介导SHIP基因转染K562细胞,探讨SHIP基因改变及功能丢失与白血病发病的关系。方法:将携带SHI... 详细信息

背景与目的:SHIP基因主要表达于造血细胞,通过降解PIP3抑制PI3K/Akt信号通路而在造血细胞增殖和存活中起重要负调控作用。本研究通过慢病毒载体介导SHIP基因转染K562细胞,探讨SHIP基因改变及功能丢失与白血病发病的关系。方法:将携带SHIP基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR法检测SHIP转录水平,Westernblot法检测转染后SHIP蛋白表达及Akt磷酸化水平的变化;比较SHIP基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果:K562细胞中SHIP蛋白阴性。以携带SHIP基因的慢病毒载体转染K562细胞后,细胞增殖抑制率升高,K562-wtSHIP-FIV-G细胞的增殖抑制率由转染第3天的(9.9±1.5)%升到第5天的(40.6±2.3)%;伴有Akt磷酸化水平明显减弱;转染后,K562-wtSHIP-FIV-G组细胞p-Akt的表达水平由0.533降低到0.245(P<0.01),细胞增殖明显被抑制。此外,SHIP蛋白还能使K562细胞出现凋亡特征,Hoechst33342染色结果转染wtSHIP基因组K562细胞第5天早期凋亡率[(38.3±4.3)%]明显高于K562-FIV-G组细胞[(8.2±0.9)%]和未转染组K562细胞[(7.7±0.8)%]。结论:SHIP基因具有重要的抑制细胞增殖和促进凋亡的能力,SHIP基因缺失导致K562细胞PI3K/Akt信号途径失调,促进K562细胞增殖。

关键词：基因,肌醇5’磷酸酶慢病毒载体细胞增殖磷酸化蛋白激酶B 细胞凋亡

慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第10期43卷 791-801页

作者：周小雅贾芳英吴雪伶张可华孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的评估8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞作为慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品的可行性。方法选择8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞,通过有限稀释法挑选单克隆;建立数字PCR法检测8E5细胞内HIV-1的拷贝数和CD19-CAR-Jurkat细胞... 详细信息

目的评估8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞作为慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品的可行性。方法选择8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞,通过有限稀释法挑选单克隆;建立数字PCR法检测8E5细胞内HIV-1的拷贝数和CD19-CAR-Jurkat细胞内CAR的拷贝数;采用高通量测序技术(全基因组重测序法、改良的基因组测序法和探针杂交捕获法)对8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞的整合位点进行检测,并采用光学基因组图谱技术(optical genome mapping,OGM)对整合位点进行确认。结果经有限稀释法,挑选出3个8E5细胞克隆和6个CD19-CAR-Jurkat细胞克隆。通过数字PCR及流式细胞术检测基因拷贝数,确定8E5-D8和CD19-CAR-Jurkat 2-6作为候选细胞,并扩增冻存。数字PCR检测结果显示,8E5-D8细胞含有约1拷贝/细胞,CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞含有约13拷贝/细胞;高通量测序结果显示,8E5-D8细胞有1个整合位点,CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞有13个整合位点,与拷贝数检测结果一致。这些整合位点均通过OGM法在染色体亚显微水平进一步得到确认。结论对8E5-D8细胞和CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞的插入拷贝数及整合位点的鉴定结果表明,其可作为进一步研制CAR-T细胞慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品。

关键词：慢病毒载体整合位点数字PCR 高通量测序光学基因组图谱技术

Fe3O4纳米粒子与慢病毒载体共同感染内皮祖细胞的促血管新生和MRI示踪的应用

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高等学校化学学报 2016年第6期37卷 1148-1153页

作者：王娟周兵王欣欣吴秀娟厉婷张文科刘亢丁吉林大学第一医院长春130021 吉林大学化学学院物理化学系长春130012 超分子结构与化学国家重点实验室吉林大学化学学院长春130012

采用化学共沉淀法制备了柠檬酸钠修饰Fe_3O_4纳米粒子(NPs),使用胎牛血清(FBS)改善Fe_3O_4NPs的分散性.实验表明Fe_3O_4NPs尺寸均匀,且具有良好的稳定性,FBS浓度小于5%(体积分数)时,Fe_3O_4NPs无聚集沉淀;在300 K下,饱和磁化强度达到74... 详细信息

采用化学共沉淀法制备了柠檬酸钠修饰Fe_3O_4纳米粒子(NPs),使用胎牛血清(FBS)改善Fe_3O_4NPs的分散性.实验表明Fe_3O_4NPs尺寸均匀,且具有良好的稳定性,FBS浓度小于5%(体积分数)时,Fe_3O_4NPs无聚集沉淀;在300 K下,饱和磁化强度达到74.86×10^(-3)A·m^2/g(74.86 emu/g);核磁共振T2序列成像时,75μg/m L Fe_3O_4NPs与慢病毒载体(LV)共同标记内皮祖细胞(EPCs)成像效果良好;而且EPCs具有稳定过表达目的基因血管内皮生长因子(VEGF)的能力.利用Fe_3O_4NPs与LV共同感染EPCs,可有效促进大鼠血管生成.说明修饰后的EPCs兼具核磁共振成像(MRI)示踪和促血管生成双重功能.

关键词： Fe3O4纳米粒子内皮祖细胞慢病毒载体血管内皮生长因子磁共振成像

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慢病毒载体的改进为基因治疗带来了新的希望

中国实验血液学杂志 2013年第5期21卷 1336-1339页

作者：方芳朱平北京大学第一医院血液科北京100034

基因治疗被认为是治愈疾病的最佳方式,但是本世纪初一系列不良事件发生,使基因治疗一度受挫。通过几年来研究和改进,慢病毒以其高转染率、靶细胞中稳定的表达和良好的安全性,为基因治疗又带来了新的曙光。目前慢病毒载体在HIV感染、地... 详细信息

基因治疗被认为是治愈疾病的最佳方式,但是本世纪初一系列不良事件发生,使基因治疗一度受挫。通过几年来研究和改进,慢病毒以其高转染率、靶细胞中稳定的表达和良好的安全性,为基因治疗又带来了新的曙光。目前慢病毒载体在HIV感染、地中海贫血、X连锁的肾上腺脑白质营养不良等疾病中已开展了相关的临床试验,获得了一定的治疗效应,尚未观察到严重的与基因治疗相关的不良事件。初步取得的成果使基因治疗再次成为人们关注的热点。本文就基因治疗为何受阻于病毒载体问题,慢病毒载体的高效安全特征和慢病毒载体的制备问题进行了综述。

关键词：慢病毒载体病毒载体基因治疗临床试验