四君子汤提取物对人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞生长的抑制作用

作     者：张待娣 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李朵璐

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：四君子汤 三阴性乳腺癌 增殖 凋亡 迁移 细胞周期 转录信号转导子与激活子3 

摘      要：研究背景及目的现今,乳腺癌是女性患者中最常见的癌症,是女性死于肿瘤的第二大主要的原因。乳腺癌是一种影响全世界许多妇女的疾病,在亚洲国家,在过去的几十年中乳腺癌的发病率一直在增加。在中国的大部分城市调查显示乳腺癌的发病率和死亡率居第一位。三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(Estrogen receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)免疫组化标记均为阴性的乳腺癌,是乳腺癌中较为难治的特殊类型。与其他分型乳腺癌相比,TNBC恶性程度更高、侵袭性更强,治疗手段单一和缺乏特异性靶向药物是目前该病临床治疗的最大障碍。中医辅助治疗TNBC的重点在于益气健脾,而且,四君子汤是益气健脾的经典方剂,组成成分有人参、白术、茯苓和甘草。相关实验初步证明,四君子汤能显着改善乳腺癌的化疗和术后并发症,能显着改善乳腺癌患者的生活质量。然而,四君子汤对于肿瘤的作用机制尚不明确。因此,本研究通过提取四君子汤浓缩干粉,以乳腺癌细胞为模型,通过CCK-8检测细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验、Hoechst33342凋亡染色、流式细胞术和Western Blot技术。,来探究四君子汤提取物对于三阴性乳腺癌细胞生长作用的影响。方法1.提取四君子汤干粉,并通过检测甘草酸的含量进行质控。使用前过滤除菌。2.采用CCK-8实验检测不同浓度的四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的抑制率和增殖活力的影响。3.通过克隆形成实验检测不同浓度的四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468细胞的集落形成能力的影响。4.应用细胞划痕实验检测不同浓度的四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468迁移的影响。5.用Hoechst33342染色技术通过荧光显微镜观察四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡的影响。6.应用流式细胞术检测四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡和周期的影响。7.采用Western Blot技术检测三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞中STAT3蛋白表达水平。8.用SPSS 25.0软件中单因素方差分析各组数据的差异,实验数据采用(?)来表示,P0.05表示差异显著。结果1.四君子汤提取物能够抑制MDA-MB-468细胞的增殖,IC50为9.745 mg/mL。根据IC50选取后续实验中四君子汤提取物低、中、高浓度分别为2.5、5.0、10.0 mg/mL。采用CCK-8法检测不同时间各浓度四君子汤提取物对MDA-MB-468细胞增殖的影响。结果发现,四君子汤提取物对MDA-MB-468细胞增殖抑制作用具有时间和浓度依赖性。2.与对照组比较,四君子汤提取物作用于MDA-MB-468细胞后,细胞克隆大小和数量明显降低,四君子汤提取物高剂量组细胞几乎不能形成肉眼可见的克隆。3.与对照组比较,在划痕后48 h,四君子汤提取物5、10 mg/mL组细胞划痕愈合能力明显减弱(P0.05、0.001)。表明四君子汤提取物有抑制MDA-MB-468细胞迁移的作用,且呈浓度依赖性。4.Hoechst 33342染色结果显示四君子汤提取物各浓度组细胞凋亡形态比较明显。5.流式细胞仪凋亡检测结果表明,四君子汤提取物作用后,MDA-MB-468细胞早期凋亡率逐渐增加,与对照组比较差异显著。并且细胞总凋亡率逐渐上升,呈浓度依赖性。6.流式细胞仪周期检测发现,四君子汤提取物5、10 mg/mL组G2期细胞比对照组明显减少,且具有浓度依赖性(P0.01)。7.Western Blot显示,与对照组比较,四君子汤提取物5、10 mg/mL组蛋白表达明显降低。结论1.四君子汤提取物能够抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的增殖。2.四君子汤提取物能够促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡,使G2期细胞减少。3.四君子汤提取物对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的生长抑制作用可能与STAT3有关。