大鼠内皮抑素基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

作     者：林丽彬 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林建银

授予年度：2007年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：大鼠 内皮抑素 基因克隆 表达 融合蛋白 生物学活性 

摘      要：目的 大鼠内皮抑素基因克隆并在大肠杆菌中表达。 方法 以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT—PCR法从中扩增内皮抑素基因，并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。利用已成功转化的pthiohis-Endo融合表达重组子的大肠杆菌TOP10，在IPTG诱导下表达融合蛋白，亲和层析方法纯化，纯化产物EK酶酶切后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot鉴定，MTT法鉴定其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。 结果 从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的eDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。经过亲和层析方法纯化的内皮抑素融合蛋白行EK酶酶切后经聚丙烯酰胺电泳和Western-blot鉴定与预期相符，并能抑制人脐静脉内皮细胞增殖。 结论 成功克隆大鼠内皮抑素基因并在大肠杆菌中表达，获得具有生物学活性的内皮抑素融合蛋白，为今后自主开发利用内皮抑素进一步奠定实验基础。