β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及分子改造

作     者：张稳 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许晓明

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：β-甘露聚糖酶 筛选 克隆 表达 分子改造 

摘      要：甘露聚糖酶(EC3.***.1.78)是内切β-1,4-甘露聚糖糖苷水解酶的简称,属于半纤维素酶,能够随机水解甘露聚糖分子主链中的β-1,4-D-甘露糖苷键,在植物、动物和微生物中均有发现,目前广泛应用于在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白及能源开发等领域。其中微生物来源的β-甘露聚糖酶具有提取方便、成本低、活性高和来源稳定等显著特点因而引起了人们广泛关注。本研究从采集的土壤样品中成功筛选到一株产甘露聚糖酶的菌株***-2,并对菌株进行了鉴定,甘露聚糖酶基因的克隆表达和蛋白分子改造等研究。1.以魔芋粉为唯一的碳源,通过连续的富集培养,结合刚果红平板筛选和DNS法酶活检测等手段,成功分离出一株产甘露聚糖酶的菌株MK-2,其在摇瓶发酵培养24h后达到产酶高峰173.71U/mL。提取菌株MK-2的基因组,以27F/1492R为引物,扩增其16SrDNA序列,在NCBI网站上进行同源性比对后,构建菌株系统发育树,将菌株初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.),实验室编号为Bacillus ***-2。2.通过设计特异性引物,成功扩增出含有完整ORF(开放式阅读框)的甘露聚糖酶基因序列。序列分析表明:该基因全长为1104bp,包含完整的β-甘露聚糖酶基因编码序列,编码367个氨基酸和一个终止密码子,并将其命名为man。该基因编码的蛋白质理论分子质量是41.44 kDa,等电点为5.76。通过SignalP(http://***-dk/services/SignalP)预测其N段前31个氨基酸为信号肽。对蛋白功能进行分析得知,该蛋白由一个催化结构域组成,不含有纤维素结合结构域,且该蛋白属于糖苷水解酶26家族。利用载体pP43NMK表达外源蛋白,将重组表达载体pP43-man转化到芽孢杆菌WB800中,以Superrich培养基作为发酵产酶培养基,37℃,220rpm实验室摇瓶发酵6天达到最高酶活2852 U/mL。重组酶蛋白经硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析和透析等处理后,获得甘露聚糖酶的纯蛋白,测其比活力为2802U/mg。重组酶的酶学评价表明,酶的最适温度和pH为55℃和6.0,40℃处理,重组甘露聚糖酶具有较好的热稳定性,甘露聚糖酶在pH 6.0-7.0时具有一定的耐受性,pH过高或过低,酶活力耐受性都较差,这在一定上限制了其应用范围。酶促动力学分析,其米氏常数Km为4.5mg/mL,Vmax为5000μmol·min-1·mg-1;底物特异性分析表明,该甘露聚糖酶底物专一性较好;在金属离子对酶的影响方面,Zn2+和Ni2+对甘露聚糖酶具有很强的抑制作用,Ag+对甘露聚糖酶具有较强的促进作用。3.利用易错PCR手段,以载体pP43NMK为表达载体,芽孢杆菌WB800为宿主,构建β-甘露聚糖酶基因的突变体表达文库,以高通量的筛选手段,从3752株突变体中筛选出3株酶表达活力明显提高的菌株WBMAN-8,WBMAN-14,WBMAN-52,酶活力分别为9747U/mL,11848U/mL,10129U/mL。酶促动力学分析,其Vmax为10000μmol·min-1·mg-1,16667 μmol·min-1·mg-1,14285 μmol·min-1·mg-1,明显高于野生型。