ω-3 PUFA调节膜脂组成缓解NAFLD中内质网应激作用机制研究

作     者：陈中强 

作者单位：武汉轻工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘志国

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：ω-3PUFA 非酒精性脂肪肝 高脂饮食 肝细胞 内质网应激 钙离子 

摘      要：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)是临床上最为常见的的慢性肝病之一,其致病机制错综复杂,目前尚无有效的治疗药物。研究表明,ω-3 PUFA是食物油脂中的重要脂肪酸类营养素,在降低血脂、改善心血管功能、降低系统性炎症及增加胰岛素敏感性等方面发挥着积极作用。近来研究显示:ω-3 PUFA对NAFLD也有缓解作用,但其具体的作用机制尚不清楚。本研究通过建立高脂高胆固醇饲喂诱导的NAFLD大鼠模型,及高饱和脂肪酸(PA)负荷诱导的BRL肝细胞模型,从动物实验及细胞实验研究ω-3 PUFA对NAFLD的改善作用及其机制,为ω-3PUFA的营养作用及其对NAFLD的营养干预提供新的思路。第一部分:鱼油、紫苏油对大鼠NAFLD的改善作用目的:高脂高胆固醇饲喂Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,建立NAFLD的动物模型,观察鱼油及紫苏油对非酒精性脂肪肝的改善作用。方法:SD雄性大鼠192只,每组48只,随机分成4组:正常对照组(CON),高脂高胆固醇组(HFD),鱼油干预组(FOH),紫苏油干预组(POH)。分别于饲喂的4周、8周、12周、16周断头取血,称取体重、肝重,检测大鼠血生化指标,包括:血清肝酶(ALT、AST)、血脂(TCH、TGH、LDL-C、HDL-C、FFA),以及相关的SOD、GST活性变化。肝组织学检测:制作肝组织石蜡切片,进行苏木素-伊红(HE)染色以及Masson染色分析。分子检测:RT-PCR检测内质网应激标志基因BIP、ATP6的表达。结果:饲喂到8周时,HFD组较CON组肝指数明显升高,血清ALT、TCH、FFA水平均显著性升高,HDL-C显著性降低,肝细胞气球样变明显,呈现出大小泡混合型肝细胞脂肪变性,小叶内和汇管区炎性细胞浸润、纤维化明显,呈现典型的炎性病变;FOH组和POH组较HFD组肝指数显著降低,血清脂质指标及肝酶活性都显著性降低,肝细胞气球样变、脂肪变性、小叶内和汇管区炎性细胞浸润、纤维化均有不同程度的改善。饲喂到16周时,观察到HFD组大鼠肝细胞脂质聚积脂肪变性,并且肝组织炎性浸润和纤维化严重,而鱼油及紫苏油干预组改善效果明显。第16周的RT-PCR检测结果显示,HFD组肝组织BIP、ATP6表达都显著高于正常组大鼠,而鱼油及紫苏油能显著降低这些基因的表达。结论:高脂高胆固醇饮食诱导的NAFLD大鼠模型建立成功,鱼油、紫苏油干预能起到明显的降低血脂、改善肝功能、缓解内质网应激和NAFLD的进展。第二部分:ω-3PUFA缓解高饱和脂肪酸负荷诱导的大鼠BRL肝细胞内质网应激的作用机制研究目的:建立PA过载诱导的BRL肝细胞损伤模型,探究ω-3 PUFA缓解BRL肝细胞内质网应激的作用机制。方法:MTT实验检测不同浓度的PA孵育对BRL细胞增殖活性的影响,确定孵育浓度。设置6个细胞实验组:正常组、PA负荷组、PA+DHA干预组、PA+EPA干预组、PA+ALA干预组、PA+AA干预组。采用Real-time PCR检测ATF6、BIP、SERCA、PEMT mRNA的表达,HPLC/MS检测细胞膜磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)的组成,GC/MS检测细胞膜脂肪酸组成,Fura-2AM荧光探针检测细胞内游离Ca2+浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:PA最适孵育浓度为75μM,当PA浓度超过75μM时细胞增殖活性明显减弱,细胞开始出现大面积凋亡及死亡。PA负荷组相较于正常组内质网应激标志分子ATF6、BIP的mRNA和蛋白均表达上调,出现内质网应激;内质网膜上的钙泵蛋白SERCA mRNA表达下调;磷脂酰乙醇胺N甲基转移酶基因(PEMT)表达上调;同时膜磷脂检测结果显示:细胞膜PC/PE比值升高;胞浆内游离Ca2+浓度显著上调。各种ω-3 PUFA干预结果显示:相较于PA负荷组,ω-3 PUFA干预组SERCA mRNA表达上调,其他各检测指标都相应下调。PA+AA干预组相较于正常组ATF6、BIP、PEMT mRNA表达上调,SERCA mRNA表达下调,细胞膜PC/PE比值上调,细胞内游离Ca2+浓度显著上调;相较于PA干预组,无显著性差异。结论:PA负荷会通过上调PEMT的表达引起细胞膜PE向PC转化,导致PC/PE升高,影响内质网钙泵SERCA活性降低,不能将胞浆内Ca2+泵入内质网,导致细胞内游离Ca2+浓度升高,Ca2+稳态失衡,引起内质网应激,持续的内质网应激导致了肝细胞损伤。当用ω-3 PUFA干预时,下调了PEMT基因的表达,抑制了PE向PC转化,PC/PE降低,上调了SERCA基因的表达和活性,加速了游离Ca2+泵回到内质网储存,缓解了内质网应激,对肝细胞损伤起到了明显的改善作用,而AA(属于ω-6