单细胞测序技术研究FGFR3负调控小鼠造血干细胞增殖的分子机制

作     者：何海婷 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖业臣

授予年度：2017年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：FGFR3 HSCs 增殖 单细胞测序 

摘      要：背景和目的:造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)具有自我更新和多向分化的潜能,目前很多血液系统恶性疾病有效的治疗方法是造血干细胞移植。脐带血由于其免疫原性较弱的特点也成为造血干细胞移植的来源。虽然有很多扩增HSCs的方法,但是都难以满足临床治疗的需要。因此如何大量扩增HSCs,特别是脐带血干细胞是我们目前亟待解决的问题。有研究报道FGF1和FGF2可以在体外扩增HSCs,也有研究阐明了骨髓损伤修复过程中FGFR1促进HSCs增殖。FGF家族的四个受体中FGFR1和FGFR3都在HSCs中高表达,而前期本实验室已经通过体内实验证实FGFR3能负调控骨髓损伤条件下的HSCs增殖,那么FGFR3对HSCs的体外扩增有什么调控作用呢?本文以此为出发点,探讨FGFR3对HSCs体外增殖的调控作用及其分子机制。方法:1.利用流式细胞仪,从已建立的Fgfr3敲除小鼠中,分离造血干细胞(Flk2-LSK),运用RNA-seq技术进行了单细胞测序,对差异表达基因进行了系统的分析。2.通过细胞的体外培养实验,利用流式细胞术分析了不同生长因子对WT和KO小鼠的HSCs体外扩增能力和信号传导情况的影响。3.通过Si-stat5a病毒侵染WT组和KO组的CD117+细胞敲低Stat5基因的表达,检测其对细胞增殖的影响。4.表达FGFR3-K650E突变激活体,进一步探讨FGFR3调控HSCs增殖的机制。结果:1.单细胞测序结果发现了Fgfr3缺失后,部分信号通路受到了显著变化,绝大部分基因出现了表达上调,特别是PDGFR介导的细胞增殖信号。2.实验证实,与WT细胞相比,PDGF-BB能明显促进Fgfr3缺失HSCs的体外增殖。3.体外培养细胞在PDGF-BB的刺激下,KO组HSCs中p-STAT5和Cyclin D1表达量升高,而p-STAT1表达量下降。***5基因敲低后,代表细胞增殖水平的Brd U阳性率明显降低。***3-K650E表达后p-STAT5、p-STAT1和Cyclin D1的表达量升高。结论:在应激条件下,在小鼠HSCs中,FGFR3通过激活STAT1通路抑制HSCs的增殖;而一旦FGFR3缺失,PDGFR表达明显上调,骨髓微环境产生的PDGF-BB通过激活STAT5/Cyclin D1通路促进HSCs的增殖。