云南牛肝菌的分子鉴定及其多糖抗氧化性研究

作     者：岳万松 

作者单位：云南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈毅坚

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：牛肝菌 分子鉴定 ITS IGS1 内生真菌 抗氧化性 

摘      要：牛肝菌是一种著名的食药两用真菌,我国云南牛肝菌分布广、种类多,是牛肝菌资源的自然分布中心,但由于各种人为和自然因素的影响,使得我国牛肝菌的种质资源受到严重破坏,多样性逐渐下降。我国对牛肝菌资源的利用虽有悠久的历史,但对该资源的分类鉴定、有效保护及综合开发利用研究均仍较为滞后,对牛肝菌资源的了解十分有限。本研究比较研究了采自云南玉溪、楚雄、曲靖和文山4个地区的13个牛肝菌样品的形态特征差异,并采用r DNA ITS序列分析、r DNA IGS1序列分析、ITS-RFLP以及IGS1-RFLP等多种分子标记相结合的分子生物学分析手段对13个牛肝菌样品进行分子鉴定和遗传差异分析。本研究将形态学分类法和分子分类法相结合研究了牛肝菌的遗传多样性以及品种间亲缘关系,同时,本论文通过组织分离法得到牛肝菌内生真菌并通过ITS序列分析对其进行分类鉴定,还对牛肝菌主要活性物质多糖的体外抗氧化活性进行了实验研究。以上各方面的研究结果以期为云南牛肝菌资源的有效保护、合理开发和综合利用提供基础资料和科学依据。主要结论如下:(1)本研究根据所得样品的形态特征,并采用r DNA ITS序列分析、r DNA IGS1序列分析、ITS-RFLP以及IGS1-RFLP等多种分子标记相结合的分子生物学分析手段对13个牛肝菌样品进行分子鉴定和遗传差异分析,结果表明,用几种不同的分子标记技术获得的分类结果基本吻合,相互印证。其中ITS和IGS1序列聚类分析均将13个样品聚类为7个不同类群,两种方法聚类结果完全统一,且与传统的形态分类结果基本一致。ITS序列分析作为牛肝菌鉴定鉴别的一种普遍有效的分子手段,能将云南不同产地的13个牛肝菌样品鉴定到属甚至种的水平。此外,研究还发现IGS1序列与ITS序列分析具有同样的鉴定效果,IGS1序列分析也可以作为牛肝菌分类鉴定的一种新的分子手段;本项目还开展了对ITS序列二级结构的研究,r DNA ITS序列的RNA二级结构水平的分析鉴定结果与ITS序列聚类分析结果也相统一,所以ITS的RNA二级结构分析也可作为ITS序列分析的一种辅助手段,二者相结合能为牛肝菌的分子鉴定提供更加丰富和准确有效的“分子形态信息;ITS-RFLP指纹图谱分类结果和IGS1-RFLP指纹图谱分类结果分别与对应的ITS聚类分析结果和IGS1聚类分析结果基本吻合,可见ITS-RFLP和IGS1-RFLP指纹图谱的构建同样可以作为ITS和IGS1序列分析的一种有效的辅助分析手段,可以直接有效的对13个样品的亲缘关系进行初步分类鉴定。实验研究中还发现个别牛肝菌样品的ITS序列较保守,在2种限制性内切酶的酶切图谱中没有明显的限制酶切片段长度多态性,因此需要结合其它种类的内切酶来研究牛肝菌的ITS-RFLP,以便将未能区分开的几个种区别开来。总之,采用多种现代分子生物学研究方法再和传统的形态学分类法相结合,可为云南牛肝菌的分类鉴定研究和遗传多样性分析提供更加丰富和全面有效的分子信息,且二者的结果相互印证,更加准确可靠。(2)选取所得样品中4种长势较好的牛肝菌为材料,经无菌技术分离子实体内部组织培养,从中获得7株内生真菌,其中MW5-1、MW5-2、MW1-7和MW3-7均分离于美味牛肝菌(Blotus edulis)、HNG1-6分离于皱盖疣柄牛肝菌(Leccinum rugosiceps)、TS3-6分离于铜色牛肝菌(Boletus aereus)、HL3-8分离于华丽牛肝菌(Blotus magnificus)。根据菌株的形态特征和ITS序列分析,7株分离自云南不同地区的牛肝菌的内生真菌分别鉴定为:MW5-1为烟曲霉(Aspergillus fumigatus),MW5-2为淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum),HNG1-6为毛栓菌(Trametes hirsuta),MW1-7为金色毛壳菌(Chaetomium aureum),TS3-6为假丝酵母属真菌(Candida sp.),MW3-7为被孢霉属真菌(Mortierella sp.),HL3-8散囊菌属真散囊菌属真菌(Eurotium sp.)。实验结果可见所获的牛肝菌内生真菌差异较大,初步显示了云南野生牛肝菌内生真菌的多样性特征。(3)本研究选用产自云南的五种野生食用牛肝菌:铜色牛肝菌(Boletus aereus)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、红柄牛肝菌(Boletus erythropus)、小美牛肝菌(Boletus speciosus)和黄皮疣柄牛肝菌(Leccinum crocipodium)为研究对象,通过热水浸提,乙醇醇析和Sevag法脱蛋白等方法提取并纯化其所含多糖,测定各种总糖含量,然后比较牛肝菌种间多糖的抗氧化能力差异。结果表明:牛肝菌多糖