一个稻瘟菌新型锌指蛋白基因突变体的生物学特性分析

作     者：闫海 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张世宏

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：稻瘟菌 基因敲除和互补 ATMT T-DNA Mozf1基因 

摘      要：水稻是最重要的粮食作物之一，全球大约一半的人口以水稻为主要粮食。然而，由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)侵染水稻引起的稻瘟病却严重威胁着水稻的生产。目前，稻瘟病的控制主要依靠种植抗病品种和使用化学农药等防治措施。但是，由于稻瘟菌生理小种遗传群体的复杂性和易变性，当一个新的抗病品种大面积推广种植3到5年后，新的致病类型就会产生，从而造成抗病品种抗性丧失，再次导致稻瘟病的爆发和流行。此外杀菌剂等化学农药的长期使用不仅使稻瘟菌出现抗药性，也使稻瘟菌防治成本的节节攀升，还导致了环境的不断恶化。因此，水稻生产面临急需环保、安全的新型稻瘟病防治策略。 如何有效防治稻瘟病一直是水稻安全生产面临的最实际的问题，了解稻瘟病病原菌的生长、发育的机制和致病相关的分子调控机理是控制该病害的前提。本文从利用农杆菌介导的稻瘟菌遗传转化(ATMT)方法构建的突变体库中筛选发现一个致病相关基因Mozf1，并利用基因敲除和基因互补的方法研究了该基因在调控稻瘟菌菌丝的生长发育、抗逆性、分生孢子产孢量和形态以及致病性方面的功能作用。 本研究利用ATMT的方法构建稻瘟菌T-DNA插入突变体库，经过多次致病性筛选得到一个致病性减弱、产孢量降低的突变体T-23。通过Tail-PCR和PCR克隆产物测序，发现T-DNA插入到稻瘟菌的一个假定蛋白MGG8239.6基因中，该基因由三个外显子区域，两个内含子区域组成，全长1780bp，总共编码501个氨基酸。该基因含有两个典型的CCHC型锌指结构域，查阅相关文献资料没有发现在稻瘟菌中对该CCHC型锌指结构域的研究记录，该CCHC型锌指蛋白在稻瘟菌种的研究尚属新型。 根据稻瘟菌全基因组序列设计引物，构建基于ATMT方法进行敲除的稻瘟菌Mozf1基因的敲除载体和融合表达载体(即该基因的互补表达载体)。经过多次ATMT方法转化稻瘟菌，得到Mozf1基因的敲除转化子和互补转化子。而后对Mozf1基因敲除转化子、互补转化子以及野生型稻瘟菌进行菌丝形态、产孢量和其他生物学进行了分析。分析发现，与野生型菌株相比，在菌丝形态、产孢量和致病性等方面敲除转化子都具有不同程度的缺陷，而互补转化子性状与之相近，说明敲除突变体Mozf1基因的互补使得这些缺陷都得到恢复，证明了该基因对这些性状的调控功能。 经过以上的研究证明，Mozf1基因在调控稻瘟菌的菌丝生长，分生孢子的形成致病性的生物学性状方面起着重要的作用。