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农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子及产孢缺陷突变子T-DNA插入位点分析

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微生物学报 2011年第2期51卷 270-275页

作者：黄文杨洪江秦慧彬工业微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105... 详细信息

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105,诱导转化黑曲霉分生孢子,筛选具有潮霉素抗性的突变子。分析抗性稳定突变子菌株的表型,采用反向PCR方法分析T-DNA插入位点相邻位置的序列,并推测突变基因可能具有的功能。【结果】实验获得具有稳定潮霉素抗性转化子193株,转化率为5.6×102转化子/108分生孢子。部分转化子表型出现较为明显改变,其中一株不能产孢,对其T-DNA插入位点序列分析比对结果显示,突变基因属于超级转运家族(major facilitator superfamily,MFS)。【结论】本研究建立的农杆菌转化黑曲霉分生孢子平台,结合T-DNA插入突变位点分析,可以为黑曲霉基因组功能注释研究提供一种简便有效的途径。

关键词：黑曲霉分生孢子农杆菌介导转化 T-DNA 反向PCR

油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

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华北农学报 2021年第1期36卷 197-202页

作者：皇甫海燕史志丹郝丽芬燕孟娇宋培玲杨永青贾晓清皇甫九茹郭晨李子钦内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所内蒙古呼和浩特010031

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体。并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定... 详细信息

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体。并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,t1、t3、t4、t7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有明显差异,t9、t11与野生型nm-1相比,菌丝形态致密,没有产孢;t1、t3、t4、t7、t9突变体生长速率比野生型nm-1快,而t11显著低于野生型nm-1;6个突变体的产孢能力与野生型nm-1相比都显著下降;Southern Blot分析其T-DNA插入的拷贝数为单拷贝插入。并通过Hi tAIL-PCR技术扩增了6个突变体的右侧翼序列,经Blast比对分析,初步确定了T-DNA插入Leptosphaeria biglobosa基因组的位置,T-DNA插入的右侧翼序列可能为致病基因的部分序列,为进一步确定油菜黑胫病菌致病基因及其功能提供参考依据。

关键词：油菜黑胫病菌 T-DNA 致病力侧翼序列

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农杆菌T-DNA传递相关基因研究进展

分子植物育种 2017年第5期15卷 1752-1761页

作者：王根平张婷师志刚程汝宏国家谷子改良中心河北省农林科学院谷子研究所河北省杂粮研究实验室石家庄050035

农杆菌已广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。T-DNA的传递是农杆菌介导转化的分子基础。T-DNA的传递是一个复杂的过程,与ti质粒毒性区基因(Vir)、农杆菌染色体上毒性相关基因(chv)有关,另外植物体内部分基因也参与T-DNA的传递。T-DNA... 详细信息

农杆菌已广泛应用于单、双子叶植物的遗传转化。T-DNA的传递是农杆菌介导转化的分子基础。T-DNA的传递是一个复杂的过程,与ti质粒毒性区基因(Vir)、农杆菌染色体上毒性相关基因(chv)有关,另外植物体内部分基因也参与T-DNA的传递。T-DNA传递时在VirD1-VirD2蛋白的作用下形成t链,进一步形成t复合物,经农杆菌四型分泌系统(type IV secretion system,t4SS)穿过细菌和植物细胞膜,运输到植物细胞胞质。进入植物细胞的t复合物在植物相关蛋白的作用下经核运输和t链的整合,最终整合到植物基因组。本研究从农杆菌对植物细胞的识别和附着、农杆菌对植物信号的感知和Vir基因的活化、t链的形成、t-复合物的运输、t链进入植物细胞后的核运输和t链的整合机制及相关基因作了详细综述,探讨了农杆菌转化机制研究中的问题,对今后农杆菌转化机制研究做了展望。

关键词：遗传转化农杆菌 T-DNA Vir基因

Induction of chromosomal inversion by integration of T-DNA in the rice genome

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Journal of Genetics and Genomics 2010年第3期37卷 189-196页

作者： Chuanfeng Zhu,Jiahe Wu,Chaozu He State Key Laboratory of Plant Genomics,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China StateKeyLaboratoryofPlantGenomics InstituteofMicrobiologyChineseAcademyofSciencesBeij'ing100101China

transfer dna （T-DNA） of Agrobacterium tumefaciens integration in the plant genome may lead to rearrangements of host plant chromosomal fragments, including inversions. However, there is very little information concerning the inversion. the present study re- ports a transgenic rice line selected from a T-DNA tagged population, which displays a semi-dwarf phenotype. Molecular analysis of this mutant indicated an insertion of two tandem copies of T-DNA into a locus on the rice genome in a head to tail mode. this insertion of T-DNA resulted in the inversion of a 4.9 Mb chromosomal segment. Results of sequence analysis suggest that the chromosomal inversion resulted from the insertion of T-DNA with the help of sequence microhomology between insertion region of T-DNA and target sequence of the host plant.

关键词： Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation （AtMt） T-DNA chromosomal inversion

转GmWRKY70基因大豆的PCR检测及其T-DNA侧翼序列分析

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农业生物技术学报 2020年第7期28卷 1203-1210页

作者：杨清华董德坤操晶梅娜陈芬胡兴旺朱丹华浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所长江大学园艺园林学院浙江师范大学化学与生命科学学院

对转基因株系的PCR检测以及对T-DNA侧翼基因组序列的深入分析,可以充分了解转基因株系的特异性分子特征。本研究利用农杆菌(Agrobacterium)介导的大豆(Glycine max)子叶转化方法,获得了3个转GmWRKY70基因的大豆株系。本研究对除草剂抗... 详细信息

对转基因株系的PCR检测以及对T-DNA侧翼基因组序列的深入分析,可以充分了解转基因株系的特异性分子特征。本研究利用农杆菌(Agrobacterium)介导的大豆(Glycine max)子叶转化方法,获得了3个转GmWRKY70基因的大豆株系。本研究对除草剂抗性基因(bialaphos resistance, Bar)、目标基因GmWRKY70以及载体构建特异性片段进行PCR检测,利用高效热不对称交错PCR (high-efficient thermal asymmetric interlaced PCR, Hi-tAIL PCR)对T-DNA侧翼序列进行整合位点分析。结果表明,3个转GmWRKY70基因的大豆株系均为阳性株系。T-DNA在43 119 699～43 119 712 bp之间反向整合到大豆染色体Chr07中。T-DNA整合导致大豆染色体Chr07插入位点12 bp缺失。对于引入的T-DNA,发现左边界(left border, LB)的80 bp序列和右边界(right border, RB)的22 bp序列被截短。在导入的LB端和大豆基因组dna的整合位点上发现了两个碱基对的微同源性,而RB未发现同源性。本研究设计新的整合位点特异性引物,并验证这种转化事件,为促进分子辅助选择在育种计划中的应用提供了资料基础。

关键词：大豆转基因株系 GmWRKY70 高效热不对称交错PCR(Hi-tAIL PCR) T-DNA

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

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棉花学报 2018年第1期30卷 29-37页

作者：崔伟业周雷单柳颖张君戴小枫郭维中国农业科学院农产品加工研究所北京100193

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitAIL-PCR(High-efficiency thermal ... 详细信息

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hitAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。

关键词：大丽轮枝菌致病力 T-DNA hitAIL-PCR 侧翼序列分析

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农杆菌转化法问题探讨

中学生物教学 2022年第27期 42-44页

作者：张伟健浙江省温州市第八高级中学 325000

对高中生物学教学中有关农杆菌转化法的原理和过程进行简要分析探讨,为学生深刻理解该实验背后的原理提供借鉴,为生物学教师提供教学参考.

关键词：农杆菌转化法 ti质粒 T-DNA 生物学教学

Illumina Sequencing technology as a Method of Identifying T-DNA Insertion Loci in Activation- tagged Arabidopsis thaliana Plants

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Molecular Plant 2012年第4期5卷 948-950页

作者： Joanna K. Polko Mohamed-Ramzi temanni Martijn van Zanten Wilbert van Workum Sven Iburg Ronald Pierik Laurentius A.C.J. Voesenek Anton J.M. Peeters Plant Ecophysiology Institute of Environmental Biology Utrecht University Padualaan 8 3584 CH Utrecht The Netherlands ServiceXS BV Plesmanlaan ld 2333 BZ Leiden The Netherlands Department of Cell Biology and Molecular Genetics Maryland Pathogen Research Institute (MPRI) 3128 Biosciences Research Bldg University of Maryland College Park MD 20742 USA Molecular Plant Physiology Institute of Environmental Biology Utrecht University Padualaan 8 3584 CH Utrecht The Netherlands

Dear Editor, Forward genetic screens are commonly used as unbiased tools to isolate genes responsible for a phenotype of interest. In Arabidopsis thaliana, especially T-DNA activation tagging pop- ulations are frequently employed. these populations are gener- ated using vectors containing multiple copies of the constitutive 35S promoters derived from cau and often result in isolation i flower mosaic virus （35S CaMV） of dominant gain-of-function alleles （Weigel et al., 2000; Nakazawa et al., 2003）. this allows the study of members of large gene families that are often func- tionally redundant and, therefore, hard to identify in loss-of- function screens. Moreover, due to the dominant nature,

关键词： T-DNA 激活标签拟南芥测序技术插入位点 35S启动子识别中国农业大学

基于竞争型PCR检测T-DNA单拷贝插入方法的建立

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基于竞争型PCR检测T-DNA单拷贝插入方法的建立

作者：樊华西北大学

学位级别：硕士

生命进化和物种分化均需以基因的多样性为基础,对于基因多样性的研究,目前大部分都是通过突变体来进行各类基因功能的研究。在植物中,农杆菌介导的遗传转化被广泛用于产生突变体。突变基因的数量与宿主染色体上插入的T-DNA数量密切相关... 详细信息

生命进化和物种分化均需以基因的多样性为基础,对于基因多样性的研究,目前大部分都是通过突变体来进行各类基因功能的研究。在植物中,农杆菌介导的遗传转化被广泛用于产生突变体。突变基因的数量与宿主染色体上插入的T-DNA数量密切相关。目前由于缺乏简单可靠的方法,对一株转化植株是否含有单一拷贝的T-DNA进行鉴定仍是一个挑战。本研究以模式植物--拟南芥为对象,建立了一种基于竞争型PCR检测单拷贝T-DNA插入的检测方法。主要实验结果如下:(1)Real-time PCR不能准确鉴定转基因植株中的单拷贝T-DNA插入。以单拷贝内源基因组片段Pro HtR10为内参,通过Real-time PCR评估了单拷贝T-DNA(包含一个GFP基因)插入杂合转基因植株seb19-L中Pro HtR10和GFP片段的比值,三次独立实验显示其平均比值为3.43:1。与预期比值(2:1)相比,该实验结果(3.43:1)使我们无法确定转基因植株中的T-DNA为单拷贝插入。(2)竞争型PCR能检出dna样本中的单拷贝T-DNA插入。对组装得到目标和竞争模板为1:1的DMG&DG质粒与目标和竞争模板为2:1的2×DMG&DG质粒分别进行竞争型PCR,实验结果显示上带与下带的平均灰度比分别为0.88:1和1.35:1,表明竞争型PCR可以识别单拷贝插入的dna样本。(3)竞争型PCR能检出转基因植物中的单拷贝T-DNA插入。通过杂交,我们获得了目标和竞争模板为1:1(B5/-&M2/-和B8/-&M3-)和2:1(B5/B5&M2-和B8/B8&M3/-)的转基因株系,并对其基因组dna进行了竞争型PCR。结果显示:以B5/-&M2/-及B8/-&M3-基因组dna为模板进行竞争型PCR时,其两PCR产物的平均灰度比值分别为0.86:1及0.85:1;以B5/B5&M2及B8/B8&M3/-基因组dna为模板进行竞争型PCR时,其平均灰度比值为1.39:1及1.28:1。这些实验结果表明竞争型PCR可以用来检测转基因植株中的单拷贝T-DNA插入。(4)通用竞争子BHK的构建。竞争型PCR能被广泛地用来检测转基因植株中单拷贝T-DNA插入的前提是其拥有一个适用于绝大多数转基因植物的通用竞争子。考虑到几乎所有的转基因植物都包含卡那霉素、潮霉素或除草剂抗性基因,我们因此构建了一个包含上述三个抗性基因片段的通用竞争子BHK。利用质粒BHK&BHK(目标与竞争模板之比为1:1)和BHK&2×BHK(目标与竞争模板之比为2:1)为模板的竞争型PCR显示:其两PCR产物的灰度比分别为0.8～0.9:1及1.2～1.3:1,表明BHK能被用来作为一个通用竞争子。(5)包含单拷贝通用竞争子BHK的转基因植物BHK-1的构建。为获取适用于大多数转基因植株检测的通用竞争转基因植株,我们构建了一个包含BHK&Pro RPS5A:H2B-td tomato融合片段的T-DNA质粒,并通过荧光显微术筛选(Pro RPS5A:H2B-td tomato融合基因使转基因植物的细胞核呈现红色荧光)获得了多株稳定转化植株BHK。利用竞争型PCR扩增BHK与seb19-L杂交植物的基因组,我们分离得到了一株仅包含BHK&Pro RPS5A:H2B-td tomato单拷贝插入的转基因植物,并将其命名为BHK-1。(6)对照转基因植株BHK,BHK,BHK的构建。为消除两PCR产物之间的比值在不同实验条件下的差异,我们产生了目标BHK和竞争子BHK比例为1:1,2:1,3:1的对照转基因植株BHK,BHK,BHK。通过比较这些对照转基因植株与测试植株之间的两竞争型PCR产物之间的比值,我们能够更准确地判断测试植株中的T-DNA插入数目。

关键词： T-DNA 竞争型PCR 单拷贝拟南芥转基因植株