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棉花枯萎病菌突变体库的构建及分析

微生物学通报 2022年第1期49卷 125-138页

作者：刘叶顾爱星朱琦新疆农业大学农学院新疆乌鲁木齐830052 农林有害生物监测与安全防控重点实验室新疆乌鲁木齐830052 新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心新疆乌鲁木齐830052 新疆农业科学院核技术生物技术研究所新疆乌鲁木齐830091

【背景】棉花枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但关于棉花枯萎病菌的致病力、产孢量、生长速度及颜色变化等相关功能基因目前还不是十分明确。【目的】通过构建绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记棉花枯萎... 详细信息

【背景】棉花枯萎病逐渐成为威胁新疆海岛棉产业发展的主要病害,但关于棉花枯萎病菌的致病力、产孢量、生长速度及颜色变化等相关功能基因目前还不是十分明确。【目的】通过构建绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记棉花枯萎病菌突变体库,筛选出由于T-DNA的随机插入而导致性状发生变异的突变体,为棉花枯萎病菌功能基因筛选和研究提供材料。【方法】通过Agrobacterium tumefaciens mediated transformation(atmt)构建了GFP标记的棉花枯萎病菌的突变体库,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性,对随机选取的突变体菌落形态、生长速率、产孢量、萌发率、T-DNA插入拷贝数及致病力进行分析,从而筛选获得变异明显且稳定的突变体。【结果】利用优化后的atmt介导体系转化获得了1600株GFP标记的棉花枯萎病菌转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接7代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明潮霉素Hyg基因成功插入野生型基因组且稳定遗传。最终筛选出17株菌落表型与野生型有差异的突变体,其中包括生长缓慢型、菌丝深紫色型、菌丝淡紫色型、菌丝浅黄色型;突变体A-1致病力相较于野生型增加了21.98%,A-1产孢量相较于野生型增加了103.54%,C-6、C-7产孢量相较于野生型降低61.90%。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的棉花枯萎病菌突变体库,筛选分析获得了菌落形态、生长速率、产孢量和致病力发生变化的突变体,为进一步研究棉花枯萎病菌相关功能基因筛选奠定了基础。

关键词：棉花棉花枯萎病菌 atmt 突变体库绿色荧光蛋白

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无抗性标记转化技术在蛹虫草中的建立及应用

无抗性标记转化技术在蛹虫草中的建立及应用

作者：李波长春工业大学

学位级别：硕士

蛹虫草是非常重要的一种食药同源的可食用真菌,含有丰富的活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、和提高人体免疫力等功效,一直是广大消费者非常喜爱的功能保健食品。近年来,蛹虫草优异功能基因挖掘和定向培育高活性新菌种,一度成为热点研究领... 详细信息

蛹虫草是非常重要的一种食药同源的可食用真菌,含有丰富的活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、和提高人体免疫力等功效,一直是广大消费者非常喜爱的功能保健食品。近年来,蛹虫草优异功能基因挖掘和定向培育高活性新菌种,一度成为热点研究领域。但由于传统的真菌遗传改造方法需要使用抗性标记,而目前可使用的抗性标记基因非常有限。导致蛹虫草遗传改造面临着可用抗性基因数量不足的问题,进而限制了多个目的基因的连续敲入或敲除,因此在蛹虫草中建立高效的无抗性标记转化技术显得尤为重要。本研究选择乳清酸磷酸核糖转移酶基因(ura5)为筛选标记基因,该基因编码表达尿嘧啶合成途径中关键酶—乳清酸磷酸核糖转移酶。首先,构建了在Cmura5基因两端具有同源臂的重组质粒,Npxbthg-Cela、Npxbthg-Ctcel7a、Npxbthg-HSP88、Npxbthg-CDV56。利用在尿嘧啶缺陷型菌株Cmura5中,回补野生型Cmura5基因可实现正向选择,即回补菌株能在基础培养基上生长。在5-氟乳清酸筛选压力下,设计的同源臂对Cmura5基因进行回收,可以实现反向选择,即野生型在含有5-氟乳清酸培养基中生长受到抑制。转化结果表明,以尿嘧啶缺陷型Cmura5为出发菌株,利用农杆菌遗传转化技术,本研究导入一个重组质粒效率为75%;连续导入二个重组质粒效率为80%;连续导入三个重组质粒效率为100%;连续导入四个重组质粒效率为50%,平均转化效率为75.7%,每一轮的标记回收率均在100%,实现了4个外源基因在蛹虫草中同时表达,并且转化子可长出子实体,说明此无抗性标记转化技术对蛹虫草的生长发育基本没有影响。本研究又利用无抗性标记转化技术在蛹虫草中转入纤维素酶基因Cela,Ctcel7a,Trcel7a基因,分别获得了Cmcela,Cmctcel7a,Cmtrcel7a,Cmcpl7a(Cela和Ctcel7a),Cmcptl7a(Cela和Trcel7a)转化子,并对转化子的生长发育、活性物质产量等方面进行了分析。结果表明:转化子的菌丝生长速度与缺陷型菌株Cmura5没有差异,转化子的分生孢子产量平均是Cmura5的72.8%。转入纤维素酶基因的转化子中活性物质,如腺苷、虫草素和喷司他丁均有明显提高,转化子菌丝中的腺苷平均产量是Cmura5的1.2倍,虫草素平均产量是Cmura5的4.1倍,喷司他丁平均产量是Cmura5的2.3倍。转化子Cmcptl7a可以利用废弃菌渣(SMS)生产抗癌药物喷司他丁,固体发酵生产达到1.45mg·g的喷司他丁,液体发酵可生产434.3mg·m L的喷司他丁。综上所述,本研究在蛹虫草中建立的无抗性标记转化技术,让基因的连续敲入或敲除不受抗性基因限制,且避免了抗性基因向环境迁移扩散的可能风险。转入纤维素酶基因的转化子可以利用SMS生产高附加值的抗癌药物喷司他丁。本研究构建的无抗性标记转化平台为探究蛹虫草的生长发育、营养物质利用、子实体发育等方面的生物学功能、基因功能研究及多基因的系统改造提供了技术支持。

关键词：蛹虫草 atmt 无抗性标记 ura5 营养缺陷型标记虫草素喷司他丁

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拟轮枝镰孢atmt突变体库的构建及分析

中国农业科学 2019年第8期52卷 1380-1388页

作者：孙华马红霞丁梦军李坡石洁刘树森河北省农林科学院植物保护研究所/农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢atmt(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过atmt构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的atmt转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

关键词：玉米拟轮枝镰孢 atmt 突变体库绿色荧光蛋白转化子

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机场航站楼供电可靠性措施要点简析

建筑电气 2023年第2期42卷 3-10页

作者：杜毅威中国建筑西南设计研究院有限公司成都市610042

机场航站楼尤其是大型机场航站楼供配电可靠性是个系统工程,各个环节都不容忽视,以免出现短板效应,造成整个供配电系统可靠性达不到要求。通过分析影响供电可靠性的各个环节,结合已完成并投入使用项目的调研回访,提出保证机场航站楼供... 详细信息

机场航站楼尤其是大型机场航站楼供配电可靠性是个系统工程,各个环节都不容忽视,以免出现短板效应,造成整个供配电系统可靠性达不到要求。通过分析影响供电可靠性的各个环节,结合已完成并投入使用项目的调研回访,提出保证机场航站楼供电可靠性的措施。

关键词：机场航站楼自备电源 atmt 电弧光保护 SVG APF DVR 智能防雷

玉米大斑病菌atmt突变体库的构建及其分析

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中国农业科学 2012年第12期45卷 2384-2392页

作者：王梅娟李坡吴敏范永山谷守芹董金皋河北农业大学植物分子病理学实验室河北省农林科学院植物保护研究所唐山师范学院生命科学系

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)进行转化,构建atmt突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌... 详细信息

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)进行转化,构建atmt突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌atmt突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌atmt突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。

关键词：玉米大斑病菌 atmt 突变体库 T-DNA插入突变体

根癌农杆菌介导的反义VeFAD_2基因对少根根霉的遗传转化及其影响因子

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林业科学研究 2010年第4期23卷 592-596页

作者：刘明靖李纪元范正琪田敏范妙华中国林业科学研究院亚热带林业研究所浙江富阳311400

Agrobacteriurn tumefaciens-mediated transformation(atmt) method was used to study the genetic transformation in Rhizopus arrhizus of antisense expression vector pBI121-fad2 of VeFAD2 gene.We studied the key factors influencing transformation,such as A.tumefaciens strains,bacterial cell volume initially used,co-cultivation time,effective period and concentration of AS.The results shows that the ideal A.tumefaciens strain is AGL-1,the optimum bacterial cell volume initially used is 50-100 μL and co-culture 24 hours will get the most transformants.At co-culture period,AS induction is indispensable.It is beneficial to improve transformation ratio by adding to 200 μmol·L-1 AS at preincubate period and increasing AS concentration to 400-600 μmol·L-1 at co-culture period.It determined that antisense VeFAD2 gene has been integrated into the genome of R.arrhizus by PCR-Southern detection.

关键词： atmt VeFAD2基因遗传转化少根根霉

农杆菌介导pepA基因对黑曲霉菌丝体的遗传转化

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东北农业大学学报 2013年第5期44卷 29-35,F0002页

作者：李杰李硕然张谷楠汪天虹钟耀华赵宁东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 山东大学生命科学学院济南250100

通过重叠延伸PCR将宇佐米曲霉中1 347 bp的酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉糖化酶基因5'同源臂和3'同源臂进行拼接,构建pepA基因表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-pepA。将载体pSZH-pepA通过冻融法转化农杆... 详细信息

通过重叠延伸PCR将宇佐米曲霉中1 347 bp的酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉糖化酶基因5'同源臂和3'同源臂进行拼接,构建pepA基因表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-pepA。将载体pSZH-pepA通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉菌丝体。以PDA作为共培养培养基,乙酰丁香酮(简称AS)浓度200μmol.mL-1的条件下,28℃恒温静置培养48 h,经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株。以出发菌株作为对照,对3株重组菌株静置培养7 d后的发酵液上清进行酶活测定,结果发现酸性蛋白酶酶活最高达45.56 U.mL-1,而出发菌株的酸性蛋白酶酶活仅为3.72 U.mL-1,表明酸性蛋白酶基因pepA在高产糖化酶的黑曲霉中得到表达。研究建立了农杆菌介导的pepA基因导入黑曲霉菌丝体的转化体系,为实现酸性蛋白酶在黑曲霉菌丝体中高效表达奠定基础。

关键词：酸性蛋白酶黑曲霉重叠延伸PCR atmt

西瓜枯萎病菌T-DNA插入转化子库的构建及其质量评价

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热带作物学报 2015年第1期36卷 76-82页

作者：裴月令曾凡云彭军龙海波郭建荣中国热带农业科学院环境与植物保护研究所农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室海南海口571101

为研究西瓜枯萎病菌的致病分子机理,开展了病原菌的转化子库构建工作。采用携带潮霉素抗性p TFCM双元载体的农杆菌AGL-1介导的atmt转化方法 ,获得菌株FON-01的转化子,通过表型观察筛选突变体。结果表明:当乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/... 详细信息

为研究西瓜枯萎病菌的致病分子机理,开展了病原菌的转化子库构建工作。采用携带潮霉素抗性p TFCM双元载体的农杆菌AGL-1介导的atmt转化方法 ,获得菌株FON-01的转化子,通过表型观察筛选突变体。结果表明:当乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600为0.4、分生孢子浓度为1×106个/m L时,于28℃共培养48 h转化效率高达(663.33±24.95)个/106个孢子。构建了总数为3 832个的转化子库并对其进行了质量评价,从2 201个转化子中筛选出菌落形态、生长速度及产孢量等方面有所变异的突变体73个。病原菌转化子库的构建为进一步开展致病分子机理及相关基因克隆等方面研究奠定基础。

关键词：西瓜枯萎病菌 atmt 转化子库

基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

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生物技术通报 2011年第5期27卷 64-70页

作者：冀颖李梅蒋细良中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室北京100081

随着丝状真菌模式生物基因组测序工作的进行,其提供的大量未知功能的基因序列,为研究丝状真菌的基因功能开辟了新的方向,并已成为生命科学领域研究的热点。对基因功能研究中最新的两种方法——基因打靶和RNAi技术的原理、技术路线和特... 详细信息

随着丝状真菌模式生物基因组测序工作的进行,其提供的大量未知功能的基因序列,为研究丝状真菌的基因功能开辟了新的方向,并已成为生命科学领域研究的热点。对基因功能研究中最新的两种方法——基因打靶和RNAi技术的原理、技术路线和特点以及应用情况进行综述。

关键词：功能基因组学基因打靶 RNAi 融合PCR atmt