抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

作     者：户义 

作者单位：中国人民解放军第四军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金伯泉

授予年度：2003年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：标签融合蛋白 融合标签 Ig融合蛋白 单克隆抗体 免疫印记 ELISA 亲和层析 凋亡诱导配体 

摘      要：融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。常见的融合标签包括：多聚组氨酸(poly-His)、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白A(SPA)、免疫球蛋白的Fc段以及谷胱甘肽转移酶(GST)等。融合标签的使用不仅方便了目的蛋白的表达和纯化，同时为目的蛋白结构和功能的研究提供了便利手段。随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)已经成为生命科学发展的重点，这一时期，科学家面临的最大挑战是在整体水平上系统地、综合地研究蛋白质的结构、功能以及蛋白质与蛋白质、核酸等生物大分子之间的相互作用。蛋白质的表达和纯化是蛋白质研究的关键环节。与标签蛋白融合表达提供了一个高通量(high-through)表达和筛选功能蛋白的平台，因而为学者广泛重视，已成为一条联系基因组和蛋白质组的重要纽带。另外，融合蛋白在蛋白复合物的分离、药物筛选以及临床治疗等领域也发挥着重要作用。 单克隆抗体技术是1975年由Khler和Milstein共同创立的用于生产针对单一表位抗体的免疫学技术。由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等优点，被广泛应用于生命科学的各个领域。在蛋白质组学的研究中，针对融合标签的单克隆抗体不但可以作为亲和层析介质对融合蛋白进行分离和纯化，还可以方便地研究目的蛋白质的分布和功能，是后基因学研究的重要工具。 一 本实验中，我们制备了7株稳定分泌抗Ig融合蛋白FC段单克隆抗体的 杂交瘤细胞株FMUI7CI～7，其中FMUFCZ、F刚FC4、FMUFCS和F删FC6 为 IgGI（K）;FMUFCI、F删FC3及 FMwC7为 IgGZb（K）。7株 InAb所未 腹水效价为在 0．5～IXIO－’，酶标 a效价为在 10叫～10刁。竞争 ELISA u 生物传感器分析表明，获得的7株单克隆抗体识别7个不同的表位，其中 FMUFCS、FMUFC6和FMUFC3的表位比较接近，FMUF。2和FMU’FC4的表 位相差最远。在表位分析的基础上，我们利用FMUFC4作为包被抗体， H肚F 作为酶标记抗体，构建了用于检测Ig融合蛋白的双单抗夹心 ELISA系统，并通过选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度对其进行了 优化。敏感性与特异性试验表明该系统的检测水平达到Zv叭且与其它物 种的IgG没有交叉反应。利用该系统对COS河细胞表达的LAIRl工g融合 蛋白和抗Notch配体Deftal的嵌合抗体进行了测定，均获得浓度依赖的A 值曲线。这表明，该夹心ELISA系统能够用于细胞培养上清中的Ig融合蛋 白和嵌合抗体水平的检测。有趣的是尽管 F则FC3、FMUFCS和 F刚FC6 的表位非常接近，但在免疫印迹只有FMUFC6可同时用于Ig融合蛋白和 hlgG的免疫印迹检测，提示在蛋白质变性过程中，随着蛋白质空间结构的 破坏，许多抗体识别的表位会消失或减弱，进一步说明抗原抗体之间的特 异性反应有赖于抗原和抗体分子在空间结构上的识别，而不仅仅取决于氨 基酸在蛋白质中的线性排列。利用 FMUFCS InAb制备的亲和层析柱，对转 染后COS河细胞培养上清的LAIR1 融合蛋白进行纯化，纯化产物经 ***后显示层析所得蛋白质的分子量与理论值相符，纯度大于 80％。 这说明免疫亲和层析能够有效的纯化培养基中的Ig融合蛋白，为Ig融合蛋 白纯化提供了新的有效途径。 另外，我们对我室制备的5株抗GST、5株抗m 和 1株抗FLAG单克 隆抗体进行了比较系统的鉴定，并对其中部分单克隆抗体进行了初步应用 研究。结果表明除抗FLAG单克隆抗体的腹水效价较低，不能用于相应融 合蛋白的免疫印迹外，其他 10株单克隆抗体的腹水效价均在 10’～10’之间， 并且全部可以用于相应融合蛋白的免疫印迹检测。比较发现，抗His标签的 单克隆抗体制备的亲和层析柱对m 融合蛋白的纯化效果优于以 N iu十TA 为基质的金属亲和层析。 FasL是重要的凋亡诱导配体（poptosis inducing ligand，AIL），在免疫 防御和免疫自稳中发挥着重要作用。FasL抗原以及抗 FasL ti体在基础和临 床研究中有巨大的应用价值。我们采用基因工程技术，构建并表达了人FasL 胞膜外区与GST的融合蛋白并利用抗GST和抗hFasL的单克隆抗