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ICOS-B7h,-对新的T细胞协同刺激分子的结构和功能

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第1期18卷 98-99页

作者：户义贾卫等第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710032

T淋巴细胞是免疫细胞的重要组成部分，在细胞免疫和体液免疫的诱导均中发挥着重要作用。既往研究表明，T细胞活化是一个复杂的信号转导过程，它不仅需要T细胞受体(TCR)识别抗原呈递细胞（APC）表面的MHC：抗原肽复合物，产生第一活化信... 详细信息

T淋巴细胞是免疫细胞的重要组成部分，在细胞免疫和体液免疫的诱导均中发挥着重要作用。既往研究表明，T细胞活化是一个复杂的信号转导过程，它不仅需要T细胞受体(TCR)识别抗原呈递细胞（APC）表面的MHC：抗原肽复合物，产生第一活化信号，而且还需要两者之间其他辅助分子的相互作用提供第二活化信号，即协同刺激信号。如果缺乏这些协同刺激信号，将导致免疫无能或发生凋亡。人们把介导这些协同刺激信号的分子称为协同刺激分子。协同刺激分子的一个重要特征是：在第一信号存在的前提下，识别它们的抗体能够诱导、维持T细胞增殖并产生细胞因子。在协同刺激分子中，研究较深入的是T细胞协同刺激分子CD28以及其配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）。实验表明，CD28介导的协同刺激信号对初始T细胞的活化至关重要。但是，人类约有50%的CD8~+T细胞为CD28，并且活化后的T细胞再次激活时可以不依赖于CD28，这就表明除了CD28外，还存在其他协同刺激分子在T细胞不同阶段的活化过程中发挥着作用。

关键词：协同刺激分子 ICOS B7h

抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

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抗融合标签单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

作者：户义中国人民解放军第四军医大学

学位级别：硕士

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。... 详细信息

融合蛋白(fusion protein)是将两个或两个以上的基因通过一定方式连接在一起共同表达出的重组蛋白。标签融合蛋白(tag fusion protein)是融合蛋白的一种，它是由目的蛋白(target protein)和融合标签(fusion tag)共同构成的蛋白嵌合体。常见的融合标签包括：多聚组氨酸(poly-His)、FLAG多肽、葡萄球菌蛋白A(SPA)、免疫球蛋白的Fc段以及谷胱甘肽转移酶(GST)等。融合标签的使用不仅方便了目的蛋白的表达和纯化，同时为目的蛋白结构和功能的研究提供了便利手段。随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成，后基因组学(post-genomics)和蛋白质组学(proteomics)已经成为生命科学发展的重点，这一时期，科学家面临的最大挑战是在整体水平上系统地、综合地研究蛋白质的结构、功能以及蛋白质与蛋白质、核酸等生物大分子之间的相互作用。蛋白质的表达和纯化是蛋白质研究的关键环节。与标签蛋白融合表达提供了一个高通量(high-through)表达和筛选功能蛋白的平台，因而为学者广泛重视，已成为一条联系基因组和蛋白质组的重要纽带。另外，融合蛋白在蛋白复合物的分离、药物筛选以及临床治疗等领域也发挥着重要作用。单克隆抗体技术是1975年由Khler和Milstein共同创立的用于生产针对单一表位抗体的免疫学技术。由于单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应等优点，被广泛应用于生命科学的各个领域。在蛋白质组学的研究中，针对融合标签的单克隆抗体不但可以作为亲和层析介质对融合蛋白进行分离和纯化，还可以方便地研究目的蛋白质的分布和功能，是后基因学研究的重要工具。一本实验中，我们制备了7株稳定分泌抗Ig融合蛋白FC段单克隆抗体的杂交瘤细胞株FMUI7CI～7，其中FMUFCZ、F刚FC4、FMUFCS和F删FC6 为 IgGI（K）;FMUFCI、F删FC3及 FMwC7为 IgGZb（K）。7株 InAb所未腹水效价为在 0．5～IXIO－’，酶标 a效价为在 10叫～10刁。竞争 ELISA u 生物传感器分析表明，获得的7株单克隆抗体识别7个不同的表位，其中 FMUFCS、FMUFC6和FMUFC3的表位比较接近，FMUF。2和FMU’FC4的表位相差最远。在表位分析的基础上，我们利用FMUFC4作为包被抗体， H肚F 作为酶标记抗体，构建了用于检测Ig融合蛋白的双单抗夹心 ELISA系统，并通过选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度对其进行了优化。敏感性与特异性试验表明该系统的检测水平达到Zv叭且与其它物种的IgG没有交叉反应。利用该系统对COS河细胞表达的LAIRl工g融合蛋白和抗Notch配体Deftal的嵌合抗体进行了测定，均获得浓度依赖的A 值曲线。这表明，该夹心ELISA系统能够用于细胞培养上清中的Ig融合蛋白和嵌合抗体水平的检测。有趣的是尽管 F则FC3、FMUFCS和 F刚FC6 的表位非常接近，但在免疫印迹只有FMUFC6可同时用于Ig融合蛋白和 hlgG的免疫印迹检测，提示在蛋白质变性过程中，随着蛋白质空间结构的破坏，许多抗体识别的表位会消失或减弱，进一步说明抗原抗体之间的特异性反应有赖于抗原和抗体分子在空间结构上的识别，而不仅仅取决于氨基酸在蛋白质中的线性排列。利用 FMUFCS InAb制备的亲和层析柱，对转染后COS河细胞培养上清的LAIR1 融合蛋白进行纯化，纯化产物经 ***后显示层析所得蛋白质的分子量与理论值相符，纯度大于 80％。这说明免疫亲和层析能够有效的纯化培养基中的Ig融合蛋白，为Ig融合蛋白纯化提供了新的有效途径。另外，我们对我室制备的5株抗GST、5株抗m 和 1株抗FLAG单克隆抗体进行了比较系统的鉴定，并对其中部分单克隆抗体进行了初步应用研究。结果表明除抗FLAG单克隆抗体的腹水效价较低，不能用于相应融合蛋白的免疫印迹外，其他 10株单克隆抗体的腹水效价均在 10’～10’之间，并且全部可以用于相应融合蛋白的免疫印迹检测。比较发现，抗His标签的单克隆抗体制备的亲和层析柱对m 融合蛋白的纯化效果优于以 N iu十TA 为基质的金属亲和层析。 FasL是重要的凋亡诱导配体（poptosis inducing ligand，AIL），在免疫防御和免疫自稳中发挥着重要作用。FasL抗原以及抗 FasL ti体在基础和临床研究中有巨大的应用价值。我们采用基因工程技术，构建并表达了人FasL 胞膜外区与GST的融合蛋白并利用抗GST和抗hFasL的单克隆抗

关键词：标签融合蛋白融合标签 Ig融合蛋白单克隆抗体免疫印记 ELISA 亲和层析凋亡诱导配体

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新型免疫佐剂在淋巴细胞杂交瘤技术中的应用

免疫学杂志 2003年第6期19卷 419-423页

作者：许晓光朱勇刘雪松刘莹户义金伯泉第四军医大学免疫学教研室陕西西安710032

目的　观察新型免疫佐剂ImmunEasyTM(CpGODN)的免疫调节作用 ,并与弗氏佐剂相比较 ,探讨其在单克隆抗体制备中的应用前景。方法　将小鼠用新型免疫佐剂ImmunEasyTM 或弗氏佐剂混合原核表达的重组APRIL抗原 ,分别以常规免疫和少量抗原免... 详细信息

目的　观察新型免疫佐剂ImmunEasyTM(CpGODN)的免疫调节作用 ,并与弗氏佐剂相比较 ,探讨其在单克隆抗体制备中的应用前景。方法　将小鼠用新型免疫佐剂ImmunEasyTM 或弗氏佐剂混合原核表达的重组APRIL抗原 ,分别以常规免疫和少量抗原免疫方案免疫Balb c小鼠 ,用间接ELISA法检测不同时相小鼠免疫血清抗APRIL抗体的总效价及各类和亚类的效价。建立一种能在单个细胞水平反映小鼠B细胞分泌特异性抗体亚类的改良ELISPOT方法 ,并对两种佐剂免疫组中配对的小鼠进行检测。常规方法制备杂交瘤 ,以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤 ,比较不同佐剂免疫小鼠所获得的杂交瘤上清液的类及其亚类频率。结果　与弗氏佐剂相比 ,ImmunEasyTM 在单克隆抗体制备过程中可明显减少抗原用量 ,缩短免疫周期 ,提高免疫血清效价 ,并增加IgG2a、IgM及IgA抗体的比例。结论　在细胞融合制备鼠源性mAb中 ,应用ImmunEasyTM,可减少免疫原用量 ,提高效率 ,还可优先获得某些类及其亚类的mAb。

关键词：免疫佐剂淋巴细胞杂交瘤免疫调节作用 ImmunEasy^TM 单克隆抗体

抗Ig融合蛋白Fc段单克隆抗体的制备、鉴定与应用研究

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第2期19卷 170-171,175页

作者：户义刘雪松朱勇刘莹许晓光薛江楠金伯泉第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032

目的 :制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体 (mAb) ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法 :以hBCMA Ig融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠 ,通过细胞融合制备抗Fc段mAb ,用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚... 详细信息

目的 :制备并鉴定抗Ig融合蛋白Fc段的单克隆抗体 (mAb) ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法和纯化Fc融合蛋白的亲和层析法。方法 :以hBCMA Ig融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠 ,通过细胞融合制备抗Fc段mAb ,用ELISA等方法鉴定mAb的Ig亚类、表位以及种属特异性 ,建立用于检测Ig融合蛋白的夹心ELISA法 ;Westernblot检测mAb对变性Ig融合蛋白的反应性。将mAb与Sepharose4B交联 ,制备亲和层析柱 ,对LAIR1 Ig融合蛋白进行纯化。结果 :获得 7株稳定分泌抗Fc段mAb的杂交瘤 (FMUFc1～FMUFc7)。利用FMUFc4作为包被mAb ,FMUFc5作为酶标记mAb ,成功地建立了检测Ig融合蛋白的ELISA法 ,敏感度达到 2 μg/L ;在 7株mAb中 ,FMUFc6可用于Ig融合蛋白的Westernblot检测。用FMUFc6mAb制备的亲和层析柱 ,可有效地纯化LAIR1 Ig融合蛋白。结论 :成功地制备了抗Ig融合蛋白Fc段的mAb ,建立了可用于Ig融合蛋白检测和纯化的方法。

关键词： Ig融合蛋白 Fc段单克隆抗体夹心ELISA法亲和层析法

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抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

细胞与分子免疫学杂志 2003年第1期19卷 80-82页

作者：许晓光朱勇刘雪松田莹曹云新刘莹户义金伯泉第四军医大学基础医学部免疫学教研室陕西西安710032

目的:研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体(mAb)。方法:采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤,并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4、猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系(BLCL)... 详细信息

目的:研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体(mAb)。方法:采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤,并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4、猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系(BLCL),进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果:共获得7株可稳定分泌 mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子,其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子。结论:成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb,为研究人和猿、猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。

关键词：人CD100单克隆抗体制备鉴定

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重油催化加氢处理时的沥青质裂化反应

石油炼制与化工 1982年第2期 38-46页

作者：白户义美日本千代田化工建设株式会社综合研究所

本文介绍了千代田公司正在研究的一种重油深度精制方法——沥青质裂化过程,其主要内容包括:沥青质的裂化反应;反应前后重油性质及沥青质化学结构的变化;对反应特点、反应机理进行研究的结果;以及将沥青质裂化反应与溶剂脱沥青方法配套,... 详细信息

本文介绍了千代田公司正在研究的一种重油深度精制方法——沥青质裂化过程,其主要内容包括:沥青质的裂化反应;反应前后重油性质及沥青质化学结构的变化;对反应特点、反应机理进行研究的结果;以及将沥青质裂化反应与溶剂脱沥青方法配套,进行重油深度精制的具体实例。

关键词：沥青质溶剂脱沥青裂化反应重油石油燃料

抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子单克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第2期19卷 168-169,175页

作者：刘莹刘雪松朱勇陈丽华曹云新许晓光户义田莹金伯泉第四军医大学医学基础部免疫学教研室陕西西安710032

目的 :制备抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)单克隆抗体 (mAb) ,研究TACI分子的细胞分布。方法 :应用淋巴细胞杂交技术制备鼠源性抗TACImAb。用免疫荧光染色、流式细胞术及免疫组织化学染色法 ,对TACI在外周血单个核细... 详细信息

目的 :制备抗人跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(TACI)单克隆抗体 (mAb) ,研究TACI分子的细胞分布。方法 :应用淋巴细胞杂交技术制备鼠源性抗TACImAb。用免疫荧光染色、流式细胞术及免疫组织化学染色法 ,对TACI在外周血单个核细胞 (PBMC)上的分布进行鉴定。结果 :获得两株分泌抗TACImAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水效价达10 -7,均为IgG1亚类 ,可识别T细胞表面天然的TACI分子 ,在PHA活化的模型中 ,TACI主要表达于活化的CD4 + T细胞上。结论 :获得两株能特异性识别天然TACI分子的mAb 。

关键词：自身免疫性疾病肿瘤坏死因子超家族跨膜激活剂钙调亲环素配体 TACI 抗TACI单克隆抗体

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聚酯用萘系衍生物的生产技术动向

石油化工译丛 1992年第1期13卷 31-39页

作者：白户义美马健文

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抗3种标签蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

细胞与分子免疫学杂志 2005年第5期21卷 613-614,618页

作者：徐竹蔚刘莹户义朱参胜张圆宋朝君许晓光金伯泉第四军医大学免疫学教研室陕西西安710032

目的:制备并鉴定抗GST、His×6及FLAG的单克隆抗体(mAb)。方法:分别以含GST、His×6及FLAG标签的融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备抗相应标签蛋白的mAb。用Westernblot检测mAb对变性融合蛋白的反应性。用流式细胞术(FCM)... 详细信息

目的:制备并鉴定抗GST、His×6及FLAG的单克隆抗体(mAb)。方法:分别以含GST、His×6及FLAG标签的融合蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备抗相应标签蛋白的mAb。用Westernblot检测mAb对变性融合蛋白的反应性。用流式细胞术(FCM)检测抗FLAGmAb对细胞膜表面融合蛋白的反应性。结果:共获得12株可稳定分泌抗3种标签蛋白mAb的杂交瘤细胞(其中5株可分泌抗GSTmAb,5株可分泌抗His×6mAb,2株可分泌抗FLAGmAb)。11株mAb均可用于相应融合蛋白的Westernblot检测。1株抗FLAGmAb检测细胞膜表面融合蛋白的阳性率,与商品化的mAbM2相接近。用1株抗His×6mAb制备亲和层析柱,并用于纯化IL-8-His融合蛋白,也获得较满意的结果。结论:成功地制备了抗GST、抗His×6及抗FLAG的mAb,为含标签的融合蛋白的研究和应用提供了重要的工具。

关键词：标签蛋白 GST FLAG 单克隆抗体