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融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展

化工进展 2014年第4期33卷 993-998页

作者：吴珊珊朱芸陈珊珊何冰芳南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211816

融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白... 详细信息

融合标签是大规模生产可溶性蛋白质的有效工具,因此融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用已成为外源蛋白表达的研究热点。本文重点介绍了常用融合标签及其提高重组蛋白质可溶性表达的机理,主要用5种模型从不同的角度阐述融合标签在蛋白折叠中的作用,其中大多数功能较强的融合标签(如MBP和NusA)作为分子伴侣帮助重组蛋白正确折叠从而提高蛋白质可溶性。此外,阐述了实际应用中常用的组合标签和标签的去除。最后提出了融合标签在大规模生产可溶性蛋白质中的应用前景、面临的挑战,以及今后研究的方向。

关键词：生物技术蛋白溶解性融合标签重组蛋白质可溶性表达纯化

疏水蛋白HFBI融合标签能显著提高外源基因在植物中的表达水平

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南方医科大学学报 2015年第12期35卷 1665-1671页

作者：张西倩牟红珍马婷丁向真李志英王盛西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室宁夏银川750021

目的针对植物生物反应器中外源基因表达水平普遍较低的问题,探索和评价丝状真菌瑞氏木霉(Trichode rma re e s e i)编码的小分子疏水蛋白(Hydrophobin,HFBI)作为融合标签在植物生物反应器中提高系统表达量的应用潜力;分析其提高外源基... 详细信息

目的针对植物生物反应器中外源基因表达水平普遍较低的问题,探索和评价丝状真菌瑞氏木霉(Trichode rma re e s e i)编码的小分子疏水蛋白(Hydrophobin,HFBI)作为融合标签在植物生物反应器中提高系统表达量的应用潜力;分析其提高外源基因表达水平的可能机制。方法以绿色荧光蛋白(GFP)为报道基因,采用基因体外合成技术和亚克隆技术构建GFP和GFPHFBI融合植物表达载体。利用农杆菌渗滤技术接种植物本明烟(Nicotiana be nthamiana)。通过GFP荧光观察,荧光显微镜镜检,Western blot,ELISA和RT-PCR等实验手段测定报告基因GFP在植物中的表达情况,探明HFBI融合标签在植物中表达外源基因的作用效果和特点并分析其可能的作用机制。结果 HFBI融合标签对植物细胞无明显的细胞毒性;GFP-HFBI融合蛋白在植物中的积累水平显著高于对照;GFP-HFBI融合蛋白在细胞内形成致密的蛋白质颗粒。结论 HFBI融合标签能够显著提高外源基因在植物中的积累水平。推测形成的蛋白质颗粒隔绝了细胞内源性蛋白酶对目的表达产物的降解,进而提高了外源基因产物在细胞中的积累。

关键词：真菌疏水蛋白融合标签绿色荧光蛋白瑞氏木霉本明烟

三种融合标签对大熊猫轮状病毒结构蛋白VP6-VP7可溶性表达的影响

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浙江农业学报 2019年第7期31卷 1073-1078页

作者：文继锋申欢欢龚永平易可可杨智捷邓英颜其贵四川农业大学动物医学院

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表... 详细信息

大熊猫轮状病毒(giant panda rotavirus,GPRV)是引起幼龄大熊猫腹泻的主要病原,对圈养大熊猫产生了较大的危害。轮状病毒结构蛋白VP6是一种载体蛋白,可介导黏膜免疫反应。VP7是轮状病毒结构蛋白中主要的中和抗原。因此,VP6-VP7的融合表达作为候选抗原对该病的防治具有重要的意义。传统大肠埃希菌原核表达存在表达量低、可溶性差以及纯度低等弊端。本研究使用醛缩酶(EDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)3种融合标签,以实现获得表达量高和纯度高的GPRV-VP6-VP7重组表达蛋白。将扩增的 VP 6、 VP 7基因片段利用同源重组酶构建到含3种融合标签的表达载体pET21b上,将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行低温诱导表达。用Ni-柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Image J分析蛋白表达量和可溶性,Western blot分析得到表达的重组表达蛋白正确且具有蛋白活性。实验结果证明,EDA标签能显著促进VP6-VP7蛋白的原核可溶性表达,提高VP6-VP7蛋白表达量。

关键词：大熊猫轮状病毒(GPRV) VP6-VP7蛋白融合标签醛缩酶

利用EDA融合标签高效表达猪圆环病毒2型壳蛋白(英文)

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中国生物化学与分子生物学报 2018年第2期34卷 183-188页

作者：郭婉莹申欢欢刘起涛郑悦亭河南农业大学牧医工程学院农业部动物生物化学与营养学重点实验室郑州450002

原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表... 详细信息

原核生物作为宿主细胞被广泛应用于异源蛋白质的重组表达,并且为生物活性蛋白质的制备提供了一种高效、经济的方法,因而在分子生物学中得到普遍的应用。然而,病毒蛋白在使用原核重组表达系统进行重组表达时,会出现病毒蛋白溶解性差和表达量低等问题。因此,通过使用各种融合标签以增加目的重组蛋白的表达量和溶解性成为有效的方法。本研究通过使用3种融合标签(EDA标签、MBP标签和GST标签)以获得表达量高的可溶性重组表达猪圆环病毒2型壳蛋白;并比较3种融合标签对该蛋白表达量、溶解性和稳定性的影响。研究结果表明,EDA标签可以显著提高重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,并且能够增强该蛋白的稳定性;MBP标签可增强重组表达的猪圆环病毒2型壳蛋白表达量,但是不能改善该蛋白的稳定性;GST标签能够增强该重组表达蛋白的表达量,但是不能增强该蛋白的溶解性和稳定性。本研究将EDA作为PCV2-CP蛋白的融合标签,显著提高PCV2-CP-EDA重组蛋白的表达量和增强该重组蛋白的稳定性,为病毒蛋白的可溶性重组表达提供了一种新的融合标签。

关键词：重组表达融合标签 EDA 猪圆环病毒2型壳蛋白

融合标签PagP的序列优化对抗菌肽表达量的调控研究

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融合标签PagP的序列优化对抗菌肽表达量的调控研究

作者：张宝蓉华南农业大学

学位级别：硕士

由于抗生素耐药性病原体在全球范围内的出现,研发新型抑菌药物的需求日益增加。抗菌肽(Antibacteial peptides,AMPs)是一类在大多数生物体内都存在的阳离子小肽,具有广谱抗菌活性,且不易产生耐药性。目前常借助基因工程技术,选择易形成... 详细信息

由于抗生素耐药性病原体在全球范围内的出现,研发新型抑菌药物的需求日益增加。抗菌肽(Antibacteial peptides,AMPs)是一类在大多数生物体内都存在的阳离子小肽,具有广谱抗菌活性,且不易产生耐药性。目前常借助基因工程技术,选择易形成包涵体的融合标签构建载体,以包涵体(Inclusion body,IB)的形式通过大肠杆菌表达系统重组表达抗菌肽。本研究以Metchnikowin(Metch)、Maginin II(Mag II)、Andropin作为目的抗菌肽,棕榈酰磷脂转移酶(PagP)作为融合标签,通过1)缩短融合标签长度,降低融合蛋白的相对分子量;2)将融合标签上的相关位置的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)或异亮氨酸(Ile),提高抗菌肽相对表达量。融合标签和抗菌肽之间依次插入Ni切割识别位点、His-tag纯化标签及蛋白酶TEV识别位点(融合标签-NHT-AMPs),构建相应表达载体,并利用大肠杆菌表达系统成功表达以下优化蛋白:P100-NHT-Metch、5-P100-NHT-Metch、10-P100-NHT-Metch、PagP-NHT-Andropin、5-P100-NHT-Andropin、10-P100-NHT-Andropin、127-PagP-NHT-Mag II、135-PagP-NHT-Mag II、121-123-PagP-NHT-Mag II、127-135-PagP-NHT-Mag II、121-123-135-PagP-NHT-Mag II、121-123-127-135-PagP-N-HT-Mag II、10-P100-NHT-Metch(P135L)、5-P100-NHT-Andropin(P135L)。表达的包涵体溶解后,用Ni裂解融合蛋白,融合标签PagP和短肽HT-AMPs分离,融合标签经相应缓冲液稀释沉淀,短肽HT-AMPs经Ni-NTA纯化,再经TEV蛋白酶酶切,抗菌肽与融合标签彻底分离,继续使用CM-羧甲基纤维素阳离子交换柱脱盐,得到纯的抗菌肽。大肠杆菌的表达条件为37℃、12 h、诱导物IPTG终浓度0.3 mM;Ni裂解融合蛋白需要终浓度50 mM、溶液蛋白浓度200μM、60℃反应24 h;TEV蛋白酶作用条件为25℃反应12 h。对表达结果进行相对定量分析,重构载体pZBR04、pZBR07、pZBR09表达后抗菌肽Metch的相对表达量分别增加30.6%、31.4%、39.7%;重构载体pZBR06、pZBR08、pZBR10表达后抗菌肽Andropin的相对表达量分别增加49.7%、47.2%、35.3%;重构突变载体pZBR17-pZBR22表达后抗菌肽Mag II表达量分别增加54.4%、60.5%、44.3%、36.7%、17.4%、31.4%。表达产物纯化后检测活性,结果显示Metch对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,Mag II、Andropin对大肠杆菌MG1655和金黄色葡萄球菌均具有较好的抗菌活性。本研究为提高抗菌肽表达量提供了可行性参考,有利于抗菌肽的产业化。

关键词：抗菌肽融合标签蛋白表达蛋白纯化抗菌活性

融合标签酰基载体蛋白对外源蛋白热稳定性的影响研究

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融合标签酰基载体蛋白对外源蛋白热稳定性的影响研究

作者：周俊杰华南农业大学

学位级别：硕士

近年来,随着人们对融合标签技术的不断研究探索,有越来越多的融合蛋白标签应用于实际中。因大肠杆菌表达系统因研究背景清楚,与其他表达系统相比,有着经济高效、节约成本、步骤简便、易于后期纯化等诸多优势,因此,在生物化学与分子生物... 详细信息

近年来,随着人们对融合标签技术的不断研究探索,有越来越多的融合蛋白标签应用于实际中。因大肠杆菌表达系统因研究背景清楚,与其他表达系统相比,有着经济高效、节约成本、步骤简便、易于后期纯化等诸多优势,因此,在生物化学与分子生物学和生物技术产业化发展过程中有举足轻重地。由于许多外源蛋白在大肠杆菌表达系统中表达时,易产生包涵体或者影响外源蛋白自身的功能,而合适的融合标签可以确保目的蛋白高效生产、实际应用和长久保存,因此利用融合标签技术以提高蛋白质的可溶性、表达量、热稳定性甚至其活性的方法已被广泛应用。使用相对分子量较小并且具有超酸性的蛋白作为融合标签是一种新的解决策略。酰基载体蛋白（Acyl Carrier Protein,ACP）是生物体脂肪酸合成酶系的重要组成成份,并且在细胞内其他代谢过程中发挥重要的作用。在不同生物体内的ACP以不同形式存在,但是结构与功能及其相似,即一个具有酸性的小分子蛋白。本实验利用ACP与TEV蛋白酶（Tobacco Etch Virus protease,TEV）、绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）、α-淀粉酶（α-Amylase,Amy）融合,经高效的诱导表达后,在相应的条件下,探索融合蛋白在是对应有融合标签ACP时的可溶性表达、稳定性以及活性差别。同时探索ACP与外源蛋白的N末端或C末端相连时,对外源蛋白的稳定性的影响。实验结果表明,在一定的条件下,ACP作为融合标签可提高外源蛋白的可溶性与表达量;此外,ACP可明显的提高外源蛋白的稳定性,提高了10℃左右;当ACP与外源蛋白的N末端或C末端相连时,对提高稳定性的效果相同;经过酶活分析预测,虽然融合标签ACP在短时间会影响外源蛋白的活性,但当反应时间足够长时,含有融合标签ACP的外源蛋白的工作效果最终会超过不含有融合标签ACP的外源蛋白。

关键词：酰基载体蛋白融合标签可溶性稳定性活性

融合标签Vasp和Iasp及其突变体在大肠杆菌和毕赤酵母中的效果研究

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融合标签Vasp和Iasp及其突变体在大肠杆菌和毕赤酵母中的效果研究

作者：赵娟丽山西农业大学

学位级别：硕士

重组蛋白表达技术已广泛应用于生物、医学等领域,具有巨大的经济价值和社会效益。但目前能同时适用于原核、真核表达系统的蛋白融合标签较少。开发这类多宿主适配的新型融合标签有利于减少摸索最优表达系统的工作量,提高重组蛋白表达的... 详细信息

重组蛋白表达技术已广泛应用于生物、医学等领域,具有巨大的经济价值和社会效益。但目前能同时适用于原核、真核表达系统的蛋白融合标签较少。开发这类多宿主适配的新型融合标签有利于减少摸索最优表达系统的工作量,提高重组蛋白表达的效率。本研究基于前期研究结果,即,在大肠杆菌(Escherichia coli,Ec)中,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的Cry1Ia和Vip3Aa1杀虫蛋白的分泌信号肽(Secretory signal peptides,SPs)Iasp和Vasp均能提高e GFP(Enhanced green fluorescent protein,e GFP)的表达量。其中,Iasp引导的e GFP(Ie GFP)的高表达量给宿主提供了较高的荧光信号强度,但后者(Ve GFP)的表达量却与宿主荧光信号强度不一致。因此,本研究首先比较了Vasp和Iasp氨基酸序列的疏水性差异,并对Ie GFP和Ve GFP的可溶性进行比较分析。然后,将Vasp分别与多种分子伴侣共表达,探究后者对Ve GFP可溶性的影响。接着又将Vasp、Iasp进行缺失突变,研究这些突变体在***中单独表达或分别与特定分子伴侣共表达时对e GFP的影响。最后,在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进一步探索Vasp、Iasp及其突变体对e GFP表达的影响。通过研究,获得如下结果:1.使用Prot Scale分析Vasp和Iasp氨基酸亲疏水性表明,Iasp的整体疏水性低于Vasp。可溶性分析发现,Ve GFP在*** MC4100中几乎均为包涵体(～91%),而Ie GFP有～73%是可溶的。这就表明两种SPs之间的疏水性差异可能是导致两个宿主细胞荧光信号强度差异的重要原因。2.在*** BL21-star(DE3)菌株中,Ve GFP分别与分子伴侣Bt Sec A、Bt Csa A和Ec Sec B及其突变体Sec B7577、Sec B142和Sec B142-7577共表达,均不能阻止Ve GFP的聚集沉淀;只有与Bt TF(Bt Trigger factor,Bt TF)共表达能够促进Ve GFP的可溶性。该结果表明,Bt TF可与Ve GFP互作。***的6种缺失突变体均能提高e GFP的表达量,但它们之间的可溶性表现差别很大。在*** BL21-star(DE3)中,Ve GFP的包涵体占比高达～97.5%。而Vasp缺失疏水性较高的H-或C-区后,可溶性分别提升到～47.5%(VNCe GFP)和～48.8%(VNHe GFP);只保留H-或C-区时分别产生～75.5%(VHe GFP)和～69.8%(VCe GFP)的可溶蛋白;当同时去除H-和C-区两个疏水区时,～74.5%重组蛋白(VNe GFP)保持可溶;而仅N-区缺失后只有～14.8%的重组蛋白(VHCe GFP)出现可溶。当6种突变体分别与Bt TF共表达时,6种重组蛋白的可溶性均被提高,但总表达量有所减少。以上结果表明,Vasp序列的疏水区与e GFP的可溶性存在负相关性,而Bt TF的存在可以消除这些疏水区域对蛋白可溶性的负面影响。有趣的是,与Bt TF氨基酸序列同源性极低的Ec TF,对这些融合荧光蛋白的可溶性没有促进作用。4.鉴于Vasp的N-区(VN)疏水性较低且对蛋白可溶性负面影响较少,本研究进一步探究了Iasp的N-区(Ia N)及其3个重复串联多肽(Ia3N)对e GFP表达的影响。结果表明,在*** BL21-star(DE3)中,Ia Nhtee GFP和Ia3Nhtee GFP的表达量分别是Ihtee GFP的7.1倍和6.5倍。当与Bt TF共表达时,Ia Nhtee GFP和Ia3Nhtee GFP的可溶性分别从～77%、84%提高到～94%和96%。5.进一步将前述多种代表性融合荧光蛋白在毕赤酵母中表达。结果发现,表达VNe GFP或Ia Ne GFP的酵母细胞荧光信号强度均高于融合相应完整SPs的Ve GFP或Ie GFP。其中,表达Ia Ne GFP的宿主荧光信号强度在所有菌株中最高,是表达e GFP宿主的～1.3倍。这些结果表明Ia N序列在酵母细胞中具有作为融合标签的潜力。综上所述,在***中,SPs可以作为提高蛋白质胞内表达的融合标签,但是对蛋白质可溶性具有一定的负面影响,其影响程度与其整体疏水性有关。使用疏水性更小的N-区可以最大程度减少这种负面影响。另外,分子伴侣可以特异性识别特定类型的SPs或其突变体,如Bt TF可以识别Vasp、Iasp及其局部序列,进而增强相应重组蛋白的可溶性。部分融合标签,如Ia N在酵母细胞中也具有改善重组蛋白表达

关键词：融合标签 TF 分泌信号肽 N-区蛋白表达溶解度

新型融合标签Iasp对不同蛋白表达效果的研究

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新型融合标签Iasp对不同蛋白表达效果的研究

作者：郭俊佩山西农业大学

学位级别：硕士

重组蛋白质异源表达时通常表达量低且生成的蛋白质大多以包涵体形式存在,采用融合标签技术可有效改善重组蛋白异源表达的成功率。蛋白质的种类和特性千差万别,仅仅依靠目前为数不多的蛋白融合标签远不能满足原核表达系统的需求,因此需... 详细信息

重组蛋白质异源表达时通常表达量低且生成的蛋白质大多以包涵体形式存在,采用融合标签技术可有效改善重组蛋白异源表达的成功率。蛋白质的种类和特性千差万别,仅仅依靠目前为数不多的蛋白融合标签远不能满足原核表达系统的需求,因此需不断开发新型融合标签。实验室前期研究发现Cry1Ia蛋白的分泌信号肽（Iasp）能够显著改善e GFP和m Cherry蛋白在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达,故认为Iasp具有作为一种新型融合标签的潜力,用于改善其他重组蛋白的表达。为了验证Iasp作为新型融合标签的可行性,本研究首先对比分析了Iasp与Trx、MBP、GST、Nus A和SUMO等5种常见的蛋白融合标签对不同蛋白表达的影响。其次,为了提高Iasp标签的效果,本研究对Iasp进行了不同改造:探索了Iasp中3个区段（N区、H区和C区）不同程度缺失对Cry1Ia蛋白本身表达量和可溶性的影响;将Iasp的疏水功能区进行不同程度破坏,探究Iasp标签突变体对蛋白表达的影响;进一步研究了His标签和Iasp标签组合使用的最优方案以及His在Iasp中不同位置是否会影响Iasp的功能。通过研究,获得如下结果:（1）将Iasp与5种不同的融合标签分别连接到egfp、gdf8、mmp13和c1v3基因的5’端,形成不同的融合基因,并将其分别转化大肠杆菌BL21-star（DE3）或Transetta（DE3）感受态细胞,得到相应的大肠杆菌表达菌株。随后,用IPTG诱导融合蛋白的表达,并检测其表达量及溶解度。结果发现,不同融合标签生产e GFP、GDF8、MMP13和C1V3的能力各不相同。其中,只有Iasp、Nus A和Trx等3种融合标签可使4种蛋白成功表达。但遗憾的是这3种融合标签均不能促进4种蛋白的可溶性。这些结果表明,Iasp作为融合标签可以增强多种重组蛋白的表达量。（2）将Iasp的N端分别截取5、10、13、16、24、32、44和73个氨基酸,得到Cry1Ia D5、Cry1Ia D10、Cry1Ia D13、Cry1Ia D16、Cry1Ia D24、Cry1Ia D32、Cry1Ia D44和Cry1Ia D73等8种缺失突变体。这一系列突变体涉及对Iasp中3个区段的破坏和缺失。将这些缺失突变体基因接入p ET28a Del表达载体,并转化大肠杆菌BL21-star（DE3）菌株,进一步检测蛋白表达。结果显示,8种Cry1Ia蛋白突变体均成功表达,其中Cry1Ia D32和Cry1Ia D44的表达量高于Cry1Ia,分别为Cry1Ia的1.43和1.12倍,Cry1Ia D13和Cry1Ia D16表达量与Cry1Ia基本持平,其余4种蛋白的表达量低于Cry1Ia。可溶性检测显示,Cry1Ia D13和Cry1Ia D24蛋白表达产物大部分以可溶形式存在,Cry1Ia D73蛋白表达产物主要为包涵体,其余5种蛋白同Cry1Ia蛋白表达产物一样,约一半为可溶形式,另一半为包涵体。以上研究表明,Iasp不同程度缺失对其表达量及可溶性有不同程度的影响。（3）为改善Iasp对融合蛋白表达的影响,将Iasp的疏水功能区（H区）分别截取6、8和13个氨基酸,产生的3种Iasp标签突变体连接在e GFP蛋白的N端,在大肠杆菌BL21-star（DE3）菌株中进行表达。结果显示,诱导4 h后,Id6-e GFP、Id8-e GFP和Id13-e GFP表达量显著高于e GFP,分别为e GFP的1.6、2.4和2.8倍,且高于Ie GFP,分别为Ie GFP的1.2、1.5和1.4倍。同时,Id6-e GFP、Id8-e GFP和Id13-e GFP等3种蛋白表达产物的可溶性均高于Ie GFP表达产物的可溶性。这些结果表明,Iasp的疏水功能区破坏和缺失会减少其对重组蛋白可溶性产生的负面影响。（4）将His标签插入Iasp标签的不同位置,并将组合后的标签连接在egfp基因的5’端,得到IH1、IH2、IH3、IH4、IH5、IH6、IH7、IH8、IH9和HI共10种突变体。实验发现10种突变体蛋白在大肠杆菌中均成功表达,且与Ie GFP表达水平差异不大,但表达产物可溶性高于Ie GFP。在HI突变体的基础上,又进行Iasp数量的叠加,得到IHI、IIHI、IBD4HI和IBD8HI。研究发现4种蛋白均可在大肠杆菌中成功表达,且表达水平同以上10种蛋白基本一致。可溶性结果显示,4种蛋白同Ie GFP蛋白表达产物一样,约一半为可溶形式,另一半为包涵体。以上结果表明,His标签插入Iasp标签中的不同位置提高了融合蛋白的可溶性,但Iasp数量的叠加未对融合蛋白的表达量及可溶性造成积极影响。综上所述,Iasp作为一种新型融合标签可用于改善重组蛋白的表达,提高蛋

关键词： Cry1Ia信号肽融合标签大肠杆菌融合蛋白表达量可溶性

分子伴侣和融合标签改善TEV蛋白酶折叠的效应

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分子伴侣和融合标签改善TEV蛋白酶折叠的效应

作者：朱克骏安徽农业大学

学位级别：硕士

同义突变所引起的蛋白质折叠受损正逐渐成为人们研究的热点,人类部分基因因同义突变而罹患疾病,因此改善同义突变带来的折叠损伤至关重要。在大肠杆菌中通过同义突变提高异源蛋白表达水平的同时,也会降低特定蛋白的折叠,如烟草蚀斑病毒... 详细信息

同义突变所引起的蛋白质折叠受损正逐渐成为人们研究的热点,人类部分基因因同义突变而罹患疾病,因此改善同义突变带来的折叠损伤至关重要。在大肠杆菌中通过同义突变提高异源蛋白表达水平的同时,也会降低特定蛋白的折叠,如烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)。有关改善密码子突变体蛋白折叠的研究未见报道。为此,我们以大肠杆菌表达系统为模型,研究共表达分子伴侣或者融合标签对不同TEVp突变体蛋白折叠的影响,获得以下结果:1.定性和定量分析了共表达分子伴侣组A(GroEL、GroES和GrpE)或组B(DnaK、DnaJ和ClpB)对6种TEVp突变体(4种氨基酸突变体,2种同义突变体)表达水平的影响。16℃诱导24 h后,共表达分子伴侣组B改善TEVp突变体表达水平要高于分子伴侣组A,表明低温条件下不同分子伴侣在改善同义突变体蛋白折叠时的水平存在差异。2.定性和定量分析了热激条件下,分子伴侣对靶蛋白的折叠效应,37℃诱导4 h后,共表达分子伴侣组A改善对TEVp突变体表达水平要高于分子伴侣组B,表明在高温胁迫下只有特定的分子伴侣组对改善同义突变体蛋白折叠有作用。3.分析了两种标签及TEVp识别序列对6种TEVp突变体的的表达水平影响:重组表达的细胞的粗酶液上清液中,SDS-PAGE检测到了明显MBP融合的TEVp氨基酸突变体特异条带;而含有TEVp识别序列的融合蛋白由胞内自剪切产生的无标签TEVp突变体条带不明显;Trx标签对TEVp的表达水平没有明显改善作用。4.分析了两种标签和TEVp识别序列对6种TEVp突变体酶学活性影响。和前期研究结果相比,MBP提高TEVp氨基酸突变体的水溶性和活性,但是对同义突变体的活性没有明显作用,插入的识别序列近一步提高TEVp氨基酸突变体活性,但是对同义突变体没有明显作用。Trx标签对TEVp氨基酸突变体的水溶性没有较大改善但可提高其活性,但对同义突变体活性没有提升,插入的TEVp识别序列也没有明显提升两类突变体活性的作用。5.分析了提高胞内稀有tRNA水平对融合的TEVp突变体表达和酶学活性的影响。在RosettaTM(DE3)中,融合MBP和Trx标签的TEVp氨基酸突变的活性要比在BL21(DE3)中表达时高,Trx标签对氨基酸突变体的活性提升水平要比MBP标签高;而融合两种标签的TEVp同义突变体的活性相比在BL21(DE3)表达时没有明显的改善。综上所述,本实验证明在不同温度胁迫下,不同类型的分子伴侣改善TEVp突变体特别是同义突变体的表达水平的作用情况存在明显差异;MBP融合标签可以改善TEVp氨基酸突变体水溶性和活性,改善效应受到TEVp识别序列的影响;Trx融合标签改善TEVp氨基酸突变体的活性不受TEVp识别序列的影响;提高稀有tRNA丰度及两类融合标签对TEVp同义突变体的活性并未有较好的改善,暗示了同义突变造成的蛋白质折叠损伤是受基因水平调控的,难以在翻译后水平上被修复。

关键词：同义突变蛋白质折叠烟草蚀斑病毒蛋白酶分子伴侣融合标签