双功能抗氧化酶的设计与研究

作     者：宗慧 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕绍武

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：GPX模拟物 2-ImSeCD 羟自由基 抗氧化活性 印迹酶 

摘      要：活性氧（ROS）作为氧代谢的副产物，能够引起生物体中蛋白质及核酸的损伤，生物体针对ROS已经建立了一套完整的防御体系，在正常情况下，ROS的产生和清除处于平衡状态，但当出现氧化应激现象，即产生的ROS无法被及时清除时，就会引起生物体的氧化损伤，此外，ROS的过量积累会引发多种疾病，甚至是癌症。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）作为生物体三大抗氧化酶之一，能够利用谷胱甘肽（GSH）清除氢过氧化物，天然GPX的结构、功能及催化机制已经为大家所熟知，但是由于天然GPX分子量较大，会引起人体的免疫反应，所以临床应用困难。此外，天然GPX来源有限，稳定性差等缺点为其开发利用带来了更大的困难，因此对GPX的人工模拟就受到越来越多的关注。 一、具有清除羟自由基能力的GPX模拟物 前期研究发现，GPX的天然底物GSH能与β-环糊精（β-CD）分子结构中的疏水空腔发生分子识别，并能够很好的进入该空腔，同时Diego等发现咪唑基取代的环糊精分子具有清除羟自由基（·OH）的能力。基于以上两点，我们以β-CD为骨架，在其分子结构中两个相邻糖环的2-OH处分别引入GPX的催化原子—硒（Se）和咪唑（Im），最后通过空气氧化得到具有硒桥结构的2-ImSeCD。该分子具有较好的GPX活力，催化机制与天然GPX相同，此外，通过Fenton/Rh-B体系检测其清除·OH的能力，发现Fenton反应产生的·OH所引起的Rh-B特征吸收峰降低的现象能够被2-ImSeCD有效的抑制，说明2-ImSeCD具备清除·OH的能力。Fe2+/Vc诱导线粒体损伤实验表明，2-ImSeCD能够保护线粒体免受损伤体系中的·OH和H2O2的损伤，与体系中加入相同GPX活力的2-SeCD相比，2-ImSeCD的双功能性使其保护线粒体的效果更加明显，表现出其在抗氧化方面优势更为突出。该研究为抗氧化酶的多功能设计提供了重要的实验基础。 二、具有GPX活性的含硒生物印迹酶的研究 以胰蛋白酶（Trypsin）为骨架，通过化学突变，将Trypsin活性位点丝氨酸（Ser）的侧链羟基（-OH）突变成具有GPX催化活性且较为稳定的次硒酸（-SeO2H），形成Trypsin-SeO2H;再以氧化型谷胱甘肽（GSSG）为印迹分子，使GSH以硒硫键形式连接到Trypsin上，形成Trypsin-Se-SG;之后通过可逆变性使Trypsin-Se-SG的分子伸展，在复性过程中随着伸展蛋白的重新折叠，分子中的-Se-SG与其他结构氨基酸发生相互作用并形成稳定的局部空间构象，最终形成具有底物结合部位（与-SG形成稳定构象的结构氨基酸）和催化基团（-Se）的印迹酶Imprinted Trypsin-Se-SG（ITSeSG）。ITSeSG的GPX活力约为硒化胰蛋白酶（Trypsin-SeH）的7倍，说明通过生物印迹技术构建的底物结合部位对酶活力提高发挥了关键作用，证明了有效识别和结合底物是设计高效模拟酶的重要因素。Trypsin-Se-SG最适pH介于7.0-8.0之间，最适温度为45℃，遵循Michaelis-Menten动力学机制，其催化机制为乒乓机制，与天然GPX相同，该印迹酶的成功制备，能够为以印迹技术制备双功能/多功能抗氧化酶模拟物提供理论和实验依据，为更好理解催化过程中酶与底物的相互作用及相关催化机理奠定基础。