靶向调控β-arrestin2的表达对肝纤维化星状细胞胶原产生的影响

作     者：谷元婧 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙妩弋;魏伟

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：β-arrestin2 TGF-β1 TGF-βⅢ型受体 HSC 肝纤维化 细胞外基质 

摘      要：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是肝组织内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度增生与异常沉积,导致肝脏结构、功能异常的病理变化。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化ECM的主要来源。转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是引起HSC活化并产生胶原的主要细胞因子。β-arrestin2属于arrestin家族,是众所周知的G蛋白偶联受体的调节蛋白,同时作为支架蛋白和连接蛋白,参与受体在胞内的信号转导。近年来研究显示,β-arrestin2的异常表达与纤维化疾病的发生、发展有关。本研究探讨β-arrestin2对HSC胶原产生的影响,及其机制是否与调节TGF-βⅢ型受体(the type Ⅲ TGF-β receptor, TβRⅢ)相关,为肝纤维化的防治提供新的靶点。本实验首先建立了猪血清(porcine serum, PS)诱导的肝纤维化大鼠模型,检测了造模不同时间点大鼠肝脏β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达变化;体外以TGF-β1刺激的HSC做为胶原产生模型,检测了TGF-β1刺激不同时间点HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达情况及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况。采用激光共聚焦、免疫共沉淀、针对TβRⅢ和β-arrestin2的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),进一步探讨β-arrestin2对HSC胶原生成的影响及与TPRIII的相互作用情况。目的：体外建立猪血清诱导的肝纤维化大鼠模型;体外选取大鼠HSC-T6细胞株,TGF-β1刺激不同时间,并采用TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA干扰。观察β-arrestin2、TβRⅢ、胶原表达及相关信号通路的变化,探讨β-arrestin2与TβRⅢ的相互作用,阐明β-arrestin2在HSC胶原产生中的作用及机制,为防治肝纤维化提供新的靶点。方法：Wistar大鼠腹腔注射无菌猪血清,每周2次,诱导肝纤维化模型。分别于造模第3、6、9、12、16周末次注射24h后处死大鼠。Western blot法检测肝脏中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平的变化。体外选用HSC-T6细胞,Western blot法检测TGF-β1刺激不同时间点(0.25 h、0.5h、1 h、4 h、8 h、12 h)HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表达变化,以及Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况;分别使用针对TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA转染HSC,采用Western blot法检测转染后TβRⅢ、β-arrestin2、胶原的表达变化和Smad2、Smad3、Akt信号通路的激活情况;激光共聚焦和免疫共沉淀检测β-arrestin2、TβRⅢ的相互作用。结果：1.猪血清诱导的肝纤维化模型大鼠肝脏中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达情况Western blot检测结果显示,肝脏Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表达随肝纤维化的.形成增高,β-arrestin2的表达也逐渐增高：同时,随造模时间的延长TGF-β1的表达升高,而TβRⅢ随之降低,TβRⅡ则无明显变化。相关性分析结果表明,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ与β-arrestin2的表达呈正相关,而TβRⅢ与β-arrestin2的表达呈负相关。2. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达变化,以及Smad2、Smad3和Akt信号通路的激活情况Western blot检测结果显示,TGF-β1刺激HSC不同时间点(0.25 h、0.5 h、1 h、4 h、8 h、 12 h),β-arrestin2的表达随着TGF-β1的刺激时间延长而升高,TβRⅢ表达降低。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达也明显升高。p-Smad2、p-Smad3分别在0.5h和0.25h表达最高,p-Akt在4h达到最高。3. TβRⅢ siRNA转染HSC后TβRⅢ、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表达变化为了研究TβRⅢ在HSC中的作用,向HSC转染了针对TβRⅢ的siRNA。 Western