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临床常用β-肾上腺素受体激动剂和拮抗剂对β-arrestin2招募作用的研究

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生理学报 2022年第6期74卷 993-1004页

作者：王怡然程德琴马兰刘星复旦大学上海医学院药理研究中心上海200032 复旦大学脑科学研究院上海200032

大量β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)药物被应用于心血管疾病等临床疾病的治疗,但许多常用的β-AR药物对下游β-arrestin偏向性信号通路的激活特性和作用并不清楚。本文旨在检测临床常用的β-AR药物对β-arrestin的招募... 详细信息

大量β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor,β-AR)药物被应用于心血管疾病等临床疾病的治疗,但许多常用的β-AR药物对下游β-arrestin偏向性信号通路的激活特性和作用并不清楚。本文旨在检测临床常用的β-AR药物对β-arrestin的招募作用。我们采用TANGO(transcriptional activation following arrestin translocation)方法在稳定转染四环素反式激活因子(tetracycline transactivator protein,tTA)依赖荧光素酶报告子和β-arrestin2-TEV融合基因的HEK293细胞系(HTLA细胞)中检测β-AR配体对β-arrestin2的招募情况。β-AR被其配体激活后,β-arrestin2被募集到受体的C端,随后G蛋白耦联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)融合蛋白在TEV蛋白酶裂解位点发生裂解。裂解导致tTA的释放,tTA转移到细胞核后可激活荧光素酶报告基因的转录。结果显示,非选择性β-AR激动剂肾上腺素、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素能通过β1-AR和β2-AR招募β-arrestin2。选择性β1-AR激动剂多巴酚丁胺和得诺巴明能通过β1-AR招募β-arrestin2。选择性β2-AR激动剂沙丁胺醇和丙卡特罗能通过β2-AR招募β-arrestin2。非选择性β-AR拮抗剂阿普洛尔和吲哚洛尔能通过β1-AR招募β-arrestin2。选择性β1-AR拮抗剂塞利洛尔和贝凡洛尔能够通过β1-AR招募β-arrestin2。选择性β2-AR拮抗剂布托沙明能够通过β1-AR产生β-arrestin2招募作用。上述结果为β-AR药物的潜在作用研究提供线索,也为后续β-arrestin偏向性β-AR药物的筛选奠定研究基础。

关键词： β-肾上腺素受体 β-arrestin2 G蛋白耦联受体荧光素酶报告基因

β-arrestin2基因敲除对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

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中国实验动物学报 2022年第1期30卷 40-46页

作者：陈婷婷单杉李南汪子颖杞萌张胜男胡姗姗魏伟孙妩弋安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省协同创新中心合肥230032

目的探讨β-arrestin2基因敲除对小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,pMφ)功能的影响。方法分别分离野生型(wild type,WT)和β-arrestin2基因敲除(β-arrestin2-/-)小鼠的pMφ,Transwell法检测β-arrestin2基因敲除对pMφ迁移的影响;中性红吞噬实验检测缺失β-arrestin2基因的pMφ吞噬功能的变化;流式细胞术检测pMφ表面分子CD86的变化情况;ELISA法检测β-arrestin2基因敲除对pMφ炎性因子产生的影响;Western Blot法检测β-arrestin2、JAK1/STAT1通路相关蛋白的表达。结果与WT组相比,敲除β-arrestin2明显降低了pMφ的迁移能力,增强了pMφ的吞噬功能,且上调pMφ表面CD86分子的表达,同时pMφ分泌炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6的水平也明显升高;Western Blot检测结果表明,缺失β-arrestin2的pMφ中p-JAK1、p-STAT1的表达明显上调。结论β-arrestin2对小鼠pMφ的迁移、吞噬、极化等功能具有调节作用,其机制可能与调控JAK1/STAT1通路有关。

关键词： β-arrestin2 腹腔巨噬细胞炎症因子 JAK1 STAT1

β-arrestin2缺失导致的小鼠骨重塑与骨组织GPER1表达下降关联

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中华内分泌代谢杂志 2015年第10期31卷 897-901页

作者：宋利革刘红霞李晓雯慕开达林紫薇赵简王琛贾伟平上海交通大学附属第六人民医院内分泌代谢科.上海市糖尿病研究所上海市糖尿病重点实验室200233 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所200031

目的探讨β-arrestin2缺失对小鼠骨重塑的影响及其发生机制。方法采用16、26、30周龄β-arrestin2敲除雌鼠和野生型雌鼠，通过双能X射线吸收法（DXA）检测其全身骨密度，微CT检测股骨微结构，RT—PCR检测骨形成、骨吸收相关因子和G蛋白... 详细信息

目的探讨β-arrestin2缺失对小鼠骨重塑的影响及其发生机制。方法采用16、26、30周龄β-arrestin2敲除雌鼠和野生型雌鼠，通过双能X射线吸收法（DXA）检测其全身骨密度，微CT检测股骨微结构，RT—PCR检测骨形成、骨吸收相关因子和G蛋白耦联雌激素受体1的表达。结果β-arrestin2敲除雌鼠在16周龄已出现全身骨密度降低，16、26、30周分别降低了8．10％、7．53％、8．56％。骨微结构检测显示3个周龄雌鼠骨体积分数均降低（分别为53．3％、49．4％、55．7％），骨小梁数量均减少（分别为53．2％、52．1％、49．3％），与各自的对照组野生型小鼠相比，差异均具有显著性（P〈0．05）。相反随着周龄的增长，敲除雌鼠骨小梁模式因子、间距、结构模型指数差异逐渐增大，至30周时与对照野生型小鼠相比差异统计学显著（分别增加了32．0％、54．3％、23．7％，P〈0．05）。胫骨RT-PCR检测显示护骨素．破骨细胞分化因子（RANKL）和G蛋白耦联雌激素受体1（GPER1）mRNA表达均降低，与对照组有明显差异（P〈0．05）。结论β-arrestin2缺失导致的小鼠骨重塑与GPERl表达相关，提示其可能通过G蛋白耦联雌激素受体信号通路影响骨重塑。

关键词： β-arrestin2 骨密度骨微结构护骨素 G蛋白耦联雌激素受体1

β-arrestin2在非小细胞肺癌患者血清中表达的临床意义

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中国肺癌杂志 2011年第6期14卷 497-501页

作者：吴正清童文侠谭子辉王思愚林鹏中山大学肿瘤防治中心胸科华南肿瘤学国家重点实验室广州510060 中山大学肿瘤防治中心妇科广州510060

背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型,具有较高的发病率及病死率。β-arrestin2是一种介导受体脱敏的重要可溶性蛋白质,在G蛋白偶联受体介导的信号转导中具有重要调节作用。本研究旨在探讨β... 详细信息

背景与目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌中最常见的类型,具有较高的发病率及病死率。β-arrestin2是一种介导受体脱敏的重要可溶性蛋白质,在G蛋白偶联受体介导的信号转导中具有重要调节作用。本研究旨在探讨β-arrestin2在NSCLC患者血清中的表达,并探讨其临床意义。方法选取留有血清标本的2005年1月-2006年12月于中山大学肿瘤防治中心治疗并确诊的NSCLC患者67例及正常体检者20例,采用ELISA方法测定选取血清标本中β-arrestin2蛋白的表达情况,并对相应病例的临床及随访资料进行回顾性分析。结果 NSCLC患者组别均较正常人组别血清β-arrestin2浓度低(Pβ-arrestin2浓度高(Pβ-arrestin2浓度无差异(P=0.273)。Kaplan-Meier分析显示β-arrestin2高表达患者较中、低表达患者预后更好(Pβ-arrestin2浓度和肿瘤分期对预后具有明显意义(P=0.003,P=0.004)。结论β-arrestin2在正常人和NSCLC患者、不同病理分期NSCLC患者血清中浓度有差异。血清β-arrestin2浓度影响NSCLC患者预后。

关键词： β-arrestin2 肺肿瘤预后因素

β-arrestin2 plays a critical role in reward behaviors induced by cocaine

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β-arrestin2 plays a critical role in reward behaviors induc...

β-arrestin2通过破坏肠上皮屏障功能而促进小鼠肠炎

中国生理学会第24届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：刘星尹旭明黄冰马兰复旦大学上海医学院药理研究中心

Besides its role in desensitization and internalization of receptors,β-arrestin2 facilitates G protein-independent signaling through its ability to scaffold various signaling molecules.β-arrestin2 is widely distributed in the central nervous system,and mediates signal transduction of brain *** aim of the present study was to investigate the role ofβ-arrestin2 in reward behaviors induced by *** assessed the conditioned place preference（CPP）induced by low（10 mg/kg）,moderate（20 mg/kg）and high（30 mg/kg）doses of cocaine in Arrb2-/-mice and Arrb2+/+*** the Arrb2-/-mice,moderate and high,but not low,dose of cocaine induced pronounced increases of CPP scores,which were higher than those in the Arrb2+/+***,cocaine-induced locomotor activity was significantly lower in Arrb2-/-mice than that of Arrb2+/+littermate *** together,our results suggest a potential role ofβ-arrestin2 in the cocaine-induced rewarding behaviors.

关键词： β-arrestin2 cocaine conditioned place preference locomotor activity

来源： cnki会议评论

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实用医学杂志 2017年第14期33卷 2291-2294页

作者：蔡丽婷何琼艾修云陈振峰智发朝南方医科大学南方医院消化科广东省南方消化病研究所广州市510515 暨南大学附属第一医院消化科广州市510630 南方医科大学基础医学院广州市510515

目的观察β-arrestin2对小鼠肠炎进展的影响,并从肠上皮屏障功能方面探讨β-arrestin2作用机制。方法用葡聚糖硫酸钠(DSS)制备小鼠急性肠炎模型,将实验对象分为3组:野生型对照(WT)组、野生型肠炎(WT+DSS)组和β-arrestin2^(-/-)肠炎(KO+... 详细信息

目的观察β-arrestin2对小鼠肠炎进展的影响,并从肠上皮屏障功能方面探讨β-arrestin2作用机制。方法用葡聚糖硫酸钠(DSS)制备小鼠急性肠炎模型,将实验对象分为3组:野生型对照(WT)组、野生型肠炎(WT+DSS)组和β-arrestin2^(-/-)肠炎(KO+DSS)组。比较β-arrestin2在WT组和WT+DSS组结肠中m RNA和蛋白表达水平;比较WT+DSS组和KO+DSS组的体重下降程度、疾病活动指数、脾脏重量、结肠长度及病理学表现、肠上皮FITC-D渗透率及紧密连接蛋白(occludin,claudin1,ZO-1)表达水平。结果β-arrestin2在WT+DSS组小鼠结肠中的m RNA和蛋白水平高于WT组;相比于WT+DSS组,KO+DSS组体重下降程度小(P2),肠上皮渗透率更低(P=0.009),occludin和claudin1蛋白表达水平更高,ZO-1在两组间无明显差异。结论β-arrestin2可能通过破坏肠上皮屏障而促进小鼠肠炎。

关键词： β-arrestin2 肠上皮屏障功能紧密连接肠炎炎症性肠病

siRNA沉默β-arrestin2促进肝星状细胞凋亡

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中国药理学通报 2012年第5期28卷 612-616页

作者：宋杨孙妩弋胡姗姗汪庆童魏伟安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药理学教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心安徽合肥230032

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰β-arrestin2表达对大鼠肝星状细胞株(hepatic stellatecell T6,HSC-T6)凋亡的影响。方法将化学合成的siRNAβ-arrestin2以Lipofectamine包裹,转染HSC-T6细胞,设阴性对照和空白对照;采用逆转录-聚合酶链反应和Westernblot检测细胞β-arrestin2表达;采用Western blot检测细胞Bcl-2、Bax的表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA的HSC-T6细胞β-arrestin2基因及蛋白表达水平明显下调,β-arrestin2 mRNA水平和蛋白表达水平比对照组分别下调了70%±1.76%和68.43%±2.88%(P2蛋白被抑制了32.58%±3.46%(P2%(Pβ-arrestin2 siRNA的HSC-T6细胞凋亡率为37.5%,明显高于正常HSC对照组。结论 siRNAβ-arrestin2能高效抑制HSC-T6细胞β-ar-restin2表达明显减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达,从而促进HSC-T6凋亡,具有预防及治疗肝纤维化的潜力。

关键词：肝星状细胞小分子干扰RNA β-arrestin2 凋亡 Bcl-2 Bax 肝纤维化

β-arrestin2介导TLR4通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究

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β-arrestin2介导TLR4通路参与阿片激动剂肝保护作用的机制研究

作者：杨瑜汀第二军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:肝缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI)是临床上常见的病理生理过程,多见于肝叶切除、肝移植等肝脏外科相关手术,是导致围术期严重并发症的重要因素。目前,肝脏IR损伤后发生的肝功能障碍仍然是临... 详细信息

研究背景和目的:肝缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI)是临床上常见的病理生理过程,多见于肝叶切除、肝移植等肝脏外科相关手术,是导致围术期严重并发症的重要因素。目前,肝脏IR损伤后发生的肝功能障碍仍然是临床上急需解决的一个问题,如何防治这类损伤是围手术期肝保护相关领域的热点。前期研究证实阿片激动剂通过诱导i NOS的生成发挥肝保护效应,表明TLR4炎症通路与阿片激动剂的肝保护作用存在内在的联系。β-arrestin在激活阿片受体的信号转导及调控中起着重要的作用。β-arrestin作为GPCR的负调控因子,当G蛋白偶联受体激活时可易位至胞膜与受体结合,促进受体内化脱敏。β-arrestin与细胞内蛋白结合参与调节胞内信号通路传导,在细胞生长、凋亡、免疫调控等过程中发挥重要作用。已有文献已证实β-arrestin参与调节机体的炎症和免疫反应过程,通过TLR下游关键分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)调节TLR/IL-1R/NF-κB的活化,并与TRAF6结合成为负调控因子,参与多种炎症性疾病的发生发展。此外,有研究证实μ阿片受体与β-arrestin2的亲和力较其它亚型更强。本实验拟探讨β-arrestin2与TLR4受体在阿片激动剂肝保护作用中的具体机制。研究方法:1、采用小鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,比较假手术组、肝脏缺血再灌注损伤组、阿片受体激动剂预处理组、阿片受体激动剂对照组之间血清转氨酶、肝脏病理学变化的差异。为观察TLR4受体在阿片药物预处理肝保护中的作用,比较TLR4敲除小鼠和野生型小鼠的肝脏缺血再灌注组和阿片激动剂预处理组的肝脏组织的TNF-α、IL-6 m RNA表达水平。并通过体外的LPS刺激RAW264.7模型模拟体内肝脏缺血再灌注损伤,比较阿片激动剂预处理组与LPS处理组的TLR4蛋白表达差异。2、采用70%的小鼠肝缺血再灌注模型,将小鼠随机分为sham组,阿片激动剂预处理组、肝缺血再灌注组、阿片激动剂对照组,检测各组小鼠肝组织的β-arrestin2的表达。体外采用RAW264.7细胞模拟肝脏Kupffer细胞,观察阿片激动剂预处理RAW264.7细胞后的β-arrestin2蛋白表达。通过采用si RNA干扰RAW264.7细胞的β-arrestin2表达,观察阿片激动剂对LPS引起的细胞的活力和凋亡的影响。3、通过采用si RNA干扰RAW264.7细胞的β-arrestin2表达,观察阿片激动剂预处理对LPS处理后的细胞的p-ERK、p-JNK蛋白表达以及β-arrestin2和TRAF6免疫共沉淀结合的影响。结果:1、阿片激动剂预处理组的小鼠血清转氨酶和肝脏组织损伤均较缺血再灌注对照组明显减低,野生型小鼠组阿片激动剂预处理减轻肝缺血再灌注小鼠的肝脏炎性因子释放,TLR4敲除小鼠组的阿片激动剂的肝保护作用消失。体外实验中,阿片激动剂减轻LPS引起的细胞中TLR4蛋白表达。2、阿片激动剂预处理引起缺血再灌注小鼠肝脏的β-arrestin2表达升高,体外的细胞实验中,阿片激动剂的预处理促进细胞中β-arrestin2的表达,并有向胞膜募集的趋势。采用si RNA干扰RAW264.7细胞的β-arrestin2后,阿片激动剂预处理对LPS导致的细胞损伤的保护作用消失。3、阿片激动剂预处理减低LPS刺激后升高的p-ERK、p-JNK蛋白表达,干扰β-arrestin2后,该作用消失。而且阿片激动剂促进β-arrestin2和TRAF6免疫复合物的形成。结论:1、阿片激动剂的预处理减轻小鼠的肝脏缺血再灌注损伤,并通过TLR4途径实现其肝保护效应。2、阿片激动剂通过β-arrestin2发挥肝保护作用,干扰β-arrestin2后阿片激动剂的肝保护作用消失。3、阿片激动剂通过β-arrestin2影响ERK1/2、JNK蛋白活化水平,并通过增加β-arrestin2与TRAF6免疫复合物形成抑制LPS引起的炎症反应。

关键词：肝脏缺血再灌注阿片激动剂 Toll样受体4 β-arrestin2

β-arrestin2及BDNF在痛觉敏化中作用机制

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β-arrestin2及BDNF在痛觉敏化中作用机制

作者：刘苑莹延安大学

学位级别：硕士

疼痛是一种极度复杂的感觉,同时伴随着实际的或者潜在的组织伤害。急性痛是机体的保护机制,通过自然转归达到治愈的目的,然而急性痛自然转归过程若中断,则可能发展为慢性痛。炎症性疼痛是一种伤害感受性疼痛,由创伤、细菌或病毒感染及... 详细信息

疼痛是一种极度复杂的感觉,同时伴随着实际的或者潜在的组织伤害。急性痛是机体的保护机制,通过自然转归达到治愈的目的,然而急性痛自然转归过程若中断,则可能发展为慢性痛。炎症性疼痛是一种伤害感受性疼痛,由创伤、细菌或病毒感染及外科手术引起的外周组织损伤导致炎症时发生的疼痛,是机体防御机制的关键组成部分。神经病理性疼痛是由外周或中枢神经系统损伤所致,与损伤区域外触觉和温觉反应异常有关。近年来,随着疼痛相关研究的深入,越来越多的分子在该过程中发挥着重要的作用。本文中,在中枢水平研究β-arrestin2在不同类型的疼痛及其疼痛时程中的作用,以及在外周水平探究BDNF在痛觉敏化时躯体感觉系统和交感神经系统互作时的作用。第一部分:探究β-arrestin2在炎性痛以及神经病理性痛中的作用研究目的:通过建立不同类型的疼痛模型,观察β-arrestin2(Arrb2)在炎性痛以及神经病理性疼痛发展过程中的作用。研究方法:1.在WT小鼠和Arrb2小鼠建立由角叉菜胶(carrageenan)诱导急性炎性痛模型和完全弗氏佐剂(CFA)诱导慢性炎性痛模型,建立SNI神经病理性疼痛模型。通过von Frey纤维丝法和热板实验测定不同时间点的机械缩足反应阈值(PWT)和热缩足反应潜伏期(PWTL)。2.利用Western Blot技术观察在β-arrestin2急性炎性痛和慢性炎性痛中脊髓腰膨大处的表达3.在脊髓腰膨大处采用鞘内给药的方式,通过von Frey纤维丝法检测小鼠给予μ受体选择性激动剂(DAMGO)后短期和长期的PWT。研究结果:1.敲除β-arrestin2后减缓急性炎性痛的恢复过程,而对慢性炎性痛的恢复具有促进作用。在神经病理性疼痛模型下,敲除β-arrestin2可减缓神经病理性疼痛前期痛敏程度,而加剧病痛后期的痛敏。2.在炎性痛模型下,对WT小鼠和Arrb2小鼠鞘内给予DAMGO,结果显示敲除β-arrestin2在急性痛的早期发挥作用不明显,在后期则可以诱发类似吗啡耐受样的痛敏反应,而在慢性痛的早期以及后期,可以显著提高μ受体的镇痛作用。3.在足底注射CFA诱导慢性炎性痛6 h以及24 h时,脊髓背角β-arrestin2表达显著下调。研究结论:β-arrestin2在不同类型的疼痛过程中起到不同的作用。第二部分:外周水平BDNF在神经病理性疼痛中调节体感-交感耦合作用的机制研究。研究目的:探究外周感受器内BDNF参与BPA后体感—交感互作机制研究方法:1.在WT小鼠建立BPA诱导神经病理性模型,通过von Frey纤维丝法测定不同时间点的机械缩足反应阈值,通过测量体温、测量水肿程度以及Cat Walk对由交感神经兴奋引起的症状进行分析。通过Western Blot技术检测BPA后小鼠DRG中BDNF、Trk B、TH、α1-AR、α2-AR的表达变化。2.造模前20 d,于BPA组分别给予DRG内注射BDNF敲除病毒和对照病毒,造模后3 d和7 d进行痛行为以及体温,水肿和Catwalk等行为学检测,并通过全细胞膜片钳技术对DRG内神经元兴奋性进行评估。3.造模后3 d和7 d进行痛行为以及体温、水肿的检测,连续5 d腹腔注射Trk B抑制剂ANA-12以及非选择性α-ARs拮抗剂酚妥拉明,随后进行痛行为以及体温、水肿和Catwalk等行为学检测,并通过全细胞膜片钳技术对DRG内神经元兴奋性进行评估。研究结果:***后,小鼠患侧前爪出现明显的机械痛敏,且该痛敏状态可维持至术后28 d,同时患侧前爪出现低体温、水肿等症状。Western Blot结果显示BPA后小鼠DRG中BDNF、Trk B、α1-AR、α2-AR的表达均升高,TH无明显变化。2.在DRG中降低BDNF的表达,可逆转BPA小鼠的机械痛敏、低体温和水肿,同对照病毒组相比具有统计学差异。全细胞膜片钳记录神经元结果显示降低BDNF的表达,可增加细胞动作电位的基强度。3.对BPA小鼠连续5 d腹腔注射Trk B抑制剂ANA-12以及非选择性α-ARs拮抗剂酚妥拉明后,可逆转BPA小鼠的机械痛敏、低体温和水肿,同溶剂组相比具有统计学差异。全细胞膜片钳记录神经元,给予ANA-12后,神经元动作电位的基强度和阈值显著增加;给予酚妥拉明后,神经元动作电位的基强度和阈值显著增加,幅值降低,两种抑制剂均可降低神经元的兴奋性。研究结论:在外周水平,BDNF是调控BPA诱发NP中体感-交感神经互作的关键分子。

关键词：炎性疼痛神经病理性疼痛 β-arrestin2 BDNF 中枢敏化外周敏化