CpG-c41对胞内型TLRs介导的免疫抑制效应及其对银屑病治疗作用的研究

作     者：刘万成 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李彦

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100206[医学-皮肤病与性病学] 10[医学] 

主      题：Cp G-c41 TLRs 药物毒性实验 咪喹莫特 银屑病 

摘      要：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)是一类由多种因素导致的慢性炎症性疾病,发病机制复杂,至今尚未完全阐明。目前临床治疗这类疾病的药物疗效不佳,副作用大,导致疾病反复发作。越来越多的研究显示,AID与固有免疫和适应性免疫紊乱密切相关。其中,在固有免疫系统激活过程中,模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)扮演着重要角色,它们能特异性识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),从而活化相关信号通路导致一系列免疫炎症反应。然而正是这些受体的过度活化,导致一系列AID的发生,如类风湿性关节炎(RA),系统性红斑狼疮(SLE)和银屑病(Psoriasis)。那么,探索并围绕AID发病机制寻找药物靶标,已成为当今治疗免疫性疾病的突破口。重要的PRRs有Toll样受体(TLRs)和NOD样受体(NLRs),它们能够特异性地识别病毒、细菌、真菌和寄生虫特定的组分,构成了固有免疫的第一防线。在TLRs家族中,根据其亚细胞定位可分为两大类,即:细胞膜表面TLRs(TLR4/MD-2,TLR1,TLR2和TLR6)和位于内质网和内体上的细胞内型TLRs(TLR3,TLR7/8和TLR9)。然而,值得注意的是,第一、TLRs受体的识别具有特异性,比如:TLR3和TLR7/8识别病毒dsRNA和ssRNA,而TLR9识别微生物DNA产生的未甲基化Cp G基序;第二、不同的TLRs对应的下游信号通路不同,如:TLR3通过TRIF信号通路,TLR7通过MyD88,导致大量炎症因子(TNF-ɑ、IL-6和干扰素等)的释放。NLRs作为另一类重要的细胞内型PRRs,参与识别宿主来源和微生物的损伤相关分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)。其中NLRP3作为NLRs蛋白家族成员之一,广泛表达于DCs和巨噬细胞。由NLRP3、ASC和无活性的caspase-1前体组成的复合体称为NLRP3炎症小体,具有调控机体慢性炎症反应的功能,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器。它能够活化caspase-1,调控IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和分泌。近年来,越来越多的研究显示AID与固有免疫中的多种PRRs的过度活化密切相关。然而,不同PRRs具有各自对应的信号通路,这种多对多的方式,使得在信号通路上寻找治疗靶位,变得尤为复杂。为了对抗这种多因子诱发的炎症反应,目前的药物开发侧重于效应阶段的遏制,譬如,在治疗银屑病时,采用TNF-?、IL-17或IL-23的抗体。尽管这种后端靶标的治疗策略,能够改善炎症因子发生后续的免疫损伤,但是对免疫的干预面太大,而伴随着免疫系统损耗,严重感染等不良反应。因此,如果在致病前端过程,寻找有效的靶标,阻断免疫系统激活,降低副作用,这将是一个更好的策略。但前端受体较多,目前仍然没有发现合适的靶标与药物。我们前期报道了一段包含未甲基化Cp G结构的20bp寡聚核苷酸(CpG-ODN)序列,命名为CpG-c41(5’-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3’),可高效抑制TLR9介导的炎症反应。后来研究发现,CpG-c41亦可显著抑制TLR7的活化,改善由酵母多糖(Zymosan)诱导的RA炎症,说明其具有了成药可能。然而,CpG-c41安全性如何,对其它TLRs是否也有影响,是否对于AID起到很好的治疗作用。为了探究CpG-c41在一定范围内的安全性和免疫学作用特点,在本课题我们进行了以下研究:目的对通过生物信息学技术,高通量筛选出的无免疫刺激性CpG-c41分子,进行初步安全性评价;探究其对不同TLRs介导的免疫学效应的影响及其机制;构建咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)诱导的银屑病样小鼠模型,观察CpG-c41对该模型的治疗作用。方法1、CpG-c41初步安全性评价动物急性毒性试验,Balb/c小鼠12只,雌雄各半,分为实验组和对照组,每组6只。实验组一次性尾静脉注射治疗剂量10倍(80mg/kg)的CpG-c41,对照组尾静脉注射等体积生理盐水(norman saline,NS),初步观察CpG-c41对动物的急性危害性质和危害强度。体外细胞毒性实验,通过CCK-8实验观察高浓度下CpG-c41(2-64μM)对于L929细胞活性的影响。2、CpG-c41对不同TLRs介导的免疫学效应研究(1)CpG-c41对不同TLRs介导的炎症因子释放的影响体外实验,使用TLR2,3,4,7/8,9激动剂分别刺激BMDMs,BMDCs和Thp-1细胞,另外联合使用TLR3,7/8,9激动剂中的两种刺激RAW264.7,同时给予Cp G-c41