黄连素对烧伤创面铜绿假单胞菌生物膜干预试验及自制中药临床应用观察

作     者：贾子中 

作者单位：内蒙古大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王凌峰;酆波

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄连素 铜绿假单胞菌 细菌生物膜 三黄烧伤灵 临床试验 

摘      要：目的：通过建立铜绿假单胞菌体外生物模型,对比黄连素和对照组细菌生物膜形态和数量,研究黄连素对铜绿假单胞菌生物膜的影响,通过对自制中药三黄烧伤灵的动物及临床使用观察,研究三黄烧伤灵的临床使用效果。方法：(1)收集烧伤科2014年1-6月微生物送检阳性标本,选取氧化酶试纸阳性菌株,经VITEK2快速细菌自动鉴定仪鉴定为铜绿假单胞菌,质控菌株ATCC27853。药敏试验采用K-B纸片扩散法,判断结果按照CLSI最新折点标准判定为耐药的作为研究菌株。(2)应用阿利新蓝-刚果红染色初筛铜绿假单胞菌定性细菌生物膜。(3)将传统的平板培养法改用聚氯乙烯薄片载体引导发培养,通过扫描电镜观察培养1天,3天,5天,7天的细胞生物膜形态,确定细胞生物膜的成熟时间。(4)利用结晶紫染色进行生物膜半定量监测,在L-B肉汤的96孔板(孔板中已加引导片)中培养,培养成熟后取出引导片,酶标仪490nm波长测定洗脱液的OD值。(5)用微量稀释法测定黄连素对临床铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)值,对比实验组和空白组扫描电镜的细菌生物膜形态,并用琼脂平板法生物膜内活菌计数。(6)通过运用三黄烧伤灵治疗大鼠深二度烧伤创面,观察该药对创面愈合情况的影响。(7)通过三黄烧伤灵临床实验观察对创面愈合情况,分析三黄烧伤灵作用于临床患者烧伤创面的效果。结果：(1)送检标本中阳性细菌耐药检出率为76.7%(115/150)。(2)阿利新蓝-刚果红染色初筛产生细菌生物膜阳性率为83.5%(96/115)。(3)电镜扫描1-3天细菌细胞生物膜形成,3天形成早期生物膜,5天形成速度变缓慢,7天形成成熟的细菌生物膜。(4)1d时,细菌量增多,OD值为0.45±0.53;持续培养3d时,细菌菌落数培养观察数量明显增多,OD值为1.21±0.49,BF逐步开始形成;持续培养5d时,电镜观察BF的形成数量成聚集模式增多,OD值2.07±0.47;持续培养到7d时,BF的形成数量电镜观察结果和第5d的量观察对比肉眼区分区别相差不大, OD值为2.12±0.35,而对照菌株在对应时间测得结果分别为：0.43±0.36,0.52±0.38,0.49±0.52,0.53±0.39,实验菌株OD值相对较高(5)黄连素对铜绿假单胞菌的生物膜的MIC为(8692ug/ml),2MIC (17384ug/ml)对细菌生物膜有抑制作用,黄连素与空白对照生物膜的细菌计数有统计学意义(P0.05)。(6)黄烧伤灵促进大鼠深二度创面的愈合。(7)通过三黄烧伤灵的临床使用观察,三黄烧伤灵对控制烧创面感染,提高创面肉芽融合率,加快创面愈合有显著功效。通过三黄烧伤灵的临床使用观察,三黄烧伤灵对控制烧创面感染,提高创面肉芽融合率,加快创面愈合有显著功效。结论：多重耐药性铜绿假单胞菌黏附于组织和生物材料表面,可以大量形成细菌生物膜并聚集,并逐步形成防渗透屏障,使铜绿假单胞菌的耐药程度加强。在细菌生物膜完全形成之前(7天),通过黄连素对铜绿假单胞菌生物膜抑制作用的研究,黄连素是一种有效的延缓细菌生物膜形成的生物碱。三黄烧伤灵作用于临床,可有效治疗烧伤创面反复感染,有显著的抑菌和杀菌,去腐生肌作用,在临床使用中值得推广。