突变型环酰亚胺水解酶的分子构象与底物专一性

作     者：陈云霞 

作者单位：山西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁静明

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：环酰亚胺水解酶 突变型酶 分子构象 带电荷氨基酸 底物专一性 

摘      要：环酰亚胺水解酶(Cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5-2.16)，是一类报道甚少的环酰胺酶类，在细菌、真菌与霉菌中分布广泛。目前，有关CIH的报道主要有三例，分别来自于Blasterbacter sp．A17-4、Alcaligelies eatrophus 112R4和Pseudomonasputida YZ-26。其中，来源于Pseudomonas putida YZ-26的CIH293为我室专利。CIH的亚基分子量约为35 kDa，其功能单位为四聚体，它的作用底物主要是简单的环酰亚胺。CIH催化水解如琥珀酰亚胺等简单环酰亚胺类底物开环生成相应的酰胺酸，后者再在半酰胺酶的作用下生成相应的二元羧酸，最后进入TCA循环。 为研究环酰亚胺水解酶(CIH293) C-端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C-末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端两个Lys替代为两个Glu或两个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE-cih为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段，并将它们分别插入到pE32M载体中，构建的重组质粒分别导入工程菌Ecoil BL21(DE3)，经诱导表达后进行菌体酶活性分析，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，CIH292、CIH291丧失约20％的活性，CIH290丧失约85％的活性，CIH289丧失全部活性;而KK292，293EE保留约80％的活性，KK292，293LL丧失90％以上的活性。根据细胞酶活性测定结果，选择CIH291、CIH290、KK292，293EE、KK292，293LL进行纯化，经Ni—NTA agarose亲和层析和Sephacryl S—200分子排阻层析获得的突变酶达到了电泳纯。 重组野生型酶与突变型酶酶活性测定、寡聚体形式、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化，仍为同源四聚体;当CIH的C-末端两个Lys替代为两个Glu时，酶活性及分子结构变化均不甚明显，但当替代为两个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态。pH及热稳定性实验也表明，酶的稳定性与其分子的完整性密切相关。结果证实CIH的C-末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用。 采用比色法与反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了重组野生型酶与突变型酶的底物专一性和动力学参数。通过对环酰亚胺类底物与其相应产物的紫外扫描选择了适宜监测波长，流动相采用水和甲醇的混合液作为洗脱系统，在水和甲醇按不同比例混合后，各底物与其相应产物均获得了良好的分离效果。对底物专一性的分析显示，突变型酶与重组野生型酶相比，底物专一性未发生显著改变，最适底物仍为琥珀酰亚胺;然动力学参数测定结果表明，突变型酶对最适底物的亲和力略有降低，导致反应速度减小。可见，酶活性的丧失是由于C-端残基缺失或替代影响了酶对最适底物的亲和力使反应速度降低所致。