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花翅摇蚊乙酰胆碱酯酶的底物专一性及对胆碱酯酶抑制剂敏感度的比较

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应用与环境生物学报 2008年第2期14卷 211-214页

作者：刘洪霞高希武冷培恩上海市疾病预防控制中心上海200336 中国农业大学昆虫系北京100094

摇蚊是重要的水生昆虫,可用于水环境质量的生物学评价.本研究以花翅摇蚊(Chironomus kiinensis)为材料,研究了花翅摇蚊乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)的底物专一性及其对胆碱酯酶抑制剂的敏感度.结果表明,花翅摇蚊AChE对乙酰... 详细信息

摇蚊是重要的水生昆虫,可用于水环境质量的生物学评价.本研究以花翅摇蚊(Chironomus kiinensis)为材料,研究了花翅摇蚊乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)的底物专一性及其对胆碱酯酶抑制剂的敏感度.结果表明,花翅摇蚊AChE对乙酰硫代胆碱(ATCh)的水解活性最高,其次是β-甲基硫代乙酰胆碱(β-MTCh)、丙酰硫代胆碱(PrTCh)和丁酰硫代胆碱(BuTCh);氨基甲酸酯药剂对花翅摇蚊AChE的抑制能力高于有机磷类,其中克百威对摇蚊AChE的抑制能力最强,I50值为1×10-8molL-1.有机磷和氨基甲酸酯类抑制剂对摇蚊AChE的抑制趋势基本一致,均随着抑制时间延长,抑制率不断增加.由此可得出,花翅摇蚊AChE的最适底物是ATCh;离体条件下,摇蚊AChE对低浓度的有机磷和氨基甲酸酯药剂比较敏感.

关键词：花翅摇蚊乙酰胆碱酯酶有机磷氨基甲酸酯底物专一性敏感性

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聚酮合成酶底物专一性的研究进展

中国抗生素杂志 2006年第11期31卷 641-645,664页

作者：朱峰乔建军天津大学化工学院天津300072

聚酮合成酶能够合成包括许多大环内酯类抗生素在内的聚酮类天然产物,它的结构和功能的模块性为组合生物合成的产生和发展奠定了基础。聚酮合成酶的酰基转移酶功能域可以特异性地决定所选择酰基辅酶A的种类,决定产物的结构。近年来,针对... 详细信息

聚酮合成酶能够合成包括许多大环内酯类抗生素在内的聚酮类天然产物,它的结构和功能的模块性为组合生物合成的产生和发展奠定了基础。聚酮合成酶的酰基转移酶功能域可以特异性地决定所选择酰基辅酶A的种类,决定产物的结构。近年来,针对许多来源不同、结构各异的聚酮合成酶的底物专一性已经从氨基酸序列、结构和功能等方面进行了大量的研究,为更有效地应用聚酮合成酶开发新型抗生素奠定了基础。

关键词：聚酮合成酶底物专一性组合生物合成酰基转移酶

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突变型环酰亚胺水解酶的底物专一性研究

中国生物工程杂志 2007年第6期27卷 46-50页

作者：陈云霞钮利喜袁静明石亚伟山西大学生物技术研究所教育部化学生物学与分子工程重点实验室太原030006

目的:研究环酰亚胺水解酶(CIH293)C-末端区残基对其底物专一性的影响。方法:通过缺失或替代获得了环酰亚胺水解酶C-末端剔除2个或3个氨基酸残基及C-末端两个Lys替代为两个Glu的突变型酶CIH291、CIH290以及KK292,293EE,用比色法与高效液... 详细信息

目的:研究环酰亚胺水解酶(CIH293)C-末端区残基对其底物专一性的影响。方法:通过缺失或替代获得了环酰亚胺水解酶C-末端剔除2个或3个氨基酸残基及C-末端两个Lys替代为两个Glu的突变型酶CIH291、CIH290以及KK292,293EE,用比色法与高效液相色谱法分析了重组野生型酶与突变型酶的底物专一性和动力学参数。结果:突变型酶与重组野生型酶相比,底物专一性未发生显著改变,最适底物仍为琥珀酰亚胺,然突变型酶对最适底物的亲和力略有降低,导致反应速度减小。结论:环酰亚胺水解酶(CIH293)C-末端区残基的改变对其底物专一性的影响不大,但影响了酶对底物的亲和力。

关键词：环酰亚胺水解酶突变型酶动力学参数底物专一性

Vibrio sp. 510产褐藻胶裂合酶的底物专一性分析

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2004年第1期34卷 55-59页

作者：江晓路刘岩胡晓珂管华诗中国海洋大学水产学院山东青岛266003

Vibrio sp.51 0具有很强的产生褐藻胶裂合酶的能力。本实验对该菌发酵产生的褐藻胶裂合酶经疏水色谱除去杂蛋白 ,再经灌注色谱分离得到 3个酶组分峰。经底物专一性检测 ,峰 1和峰 3对聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸均具降解作用 ,峰 2只对... 详细信息

Vibrio sp.51 0具有很强的产生褐藻胶裂合酶的能力。本实验对该菌发酵产生的褐藻胶裂合酶经疏水色谱除去杂蛋白 ,再经灌注色谱分离得到 3个酶组分峰。经底物专一性检测 ,峰 1和峰 3对聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸均具降解作用 ,峰 2只对聚甘露糖醛酸有降解作用。园二色谱测定酶的二级结构 :峰 1结构最为复杂 ,以β-转角为最高 ,占 31 .5% ,无规线团占 2 7% ,α-螺旋占 2 5.8% ;峰2为β-折叠 ,占 95.5% ;峰 3以 60 %的α-螺旋和 40 %的无规线团形式存在。 3个分离峰的底物专一性和二级结构的差异证明了褐藻胶裂合酶蛋白的结构与功能之间的相关性。

关键词：褐藻胶裂合酶色谱分离底物专一性嵌段线性聚合物

枸杞蚜虫乙酰胆碱酯酶(AChE)底物专一性和有机磷杀虫剂对其的抑制作用

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华北农学报 2012年第4期27卷 168-170页

作者：张海珠李海平张海燕常静内蒙古农业大学农学院内蒙古呼和浩特010019 内蒙古鄂尔多斯市伊金霍洛旗农牧业局人口转移办内蒙古伊金霍洛旗017200

为探讨有机磷杀虫剂对枸杞蚜虫的作用机制,对枸杞蚜虫乙酰胆碱酯酶的底物专一性以及3种有机磷杀虫剂对其的抑制作用进行了研究。结果表明,枸杞蚜虫AChE对乙酰硫代胆碱(ATCh)的水解活性最高,对丁酰硫代胆碱(BuTCh)的亲和力最强,对4种底... 详细信息

为探讨有机磷杀虫剂对枸杞蚜虫的作用机制,对枸杞蚜虫乙酰胆碱酯酶的底物专一性以及3种有机磷杀虫剂对其的抑制作用进行了研究。结果表明,枸杞蚜虫AChE对乙酰硫代胆碱(ATCh)的水解活性最高,对丁酰硫代胆碱(BuTCh)的亲和力最强,对4种底物的水解趋势相同;3种有机磷杀虫剂对枸杞蚜虫AChE都有抑制作用,其中,氧乐果对枸杞蚜虫AChE体外抑制最强,I50为6.9×10-6mol/L,辛硫磷和三唑磷分别为9.8×10-6和11.8×10-6mol/L;3种有机磷杀虫剂对枸杞蚜虫AChE体外抑制均随着抑制时间的延长,抑制率不断增加。

关键词：枸杞蚜虫乙酰胆碱酯酶底物专一性有机磷杀虫剂抑制

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杂色云芝组成型漆酶Ⅰ的纯化和底物专一性

中国生物化学与分子生物学报 2002年第6期18卷 737-740页

作者：李杨段新源刘稳方靖高培基山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100

采用合成培养基培养杂色云芝As5 4 8,从发酵液中纯化出一种组成型漆酶同功酶Ⅰ .经超滤浓缩 ,DEAE SephadexA 5 0离子交换层析 ,Bio gelP 10 0凝胶过滤纯化了该酶 .SDS PAGE分析发现 ,该酶分子量为 6 8kD ,薄层等电聚焦测得等电点为 3 ... 详细信息

采用合成培养基培养杂色云芝As5 4 8,从发酵液中纯化出一种组成型漆酶同功酶Ⅰ .经超滤浓缩 ,DEAE SephadexA 5 0离子交换层析 ,Bio gelP 10 0凝胶过滤纯化了该酶 .SDS PAGE分析发现 ,该酶分子量为 6 8kD ,薄层等电聚焦测得等电点为 3 5 .漆酶Ⅰ的底物范围较宽 ,以O2 为电子受体 ,可以氧化多种木素单体模型物 ,包括 2 ,6 二甲氧基酚 ,2 ,2′ 联氮二 (3 乙基苯并噻唑 6 磺酸 )(ABTS) ,愈创木酚 ,咖啡酸 ,阿魏酸和邻联茴香胺 .结果表明 ,该酶在木质素的生物降解中可能有重要的作用和应用价值 .

关键词：木素模型化合物杂色云芝组成型漆酶Ⅰ 纯化底物专一性

活性包涵体中酶催化反应和底物专一性变化研究

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活性包涵体中酶催化反应和底物专一性变化研究

作者：孙佳亓安徽农业大学

学位级别：硕士

1980年以前,人们普遍认为包涵体中的蛋白质是没有活性的,需要在体外进行复性后才能使蛋白质具有活性。近年来,越来越多的研究表明,某些蛋白质或酶,虽然表达在包涵体中,但依然保留其活性,这种包涵体被称为活性包涵体(Active Inclusion Bo... 详细信息

1980年以前,人们普遍认为包涵体中的蛋白质是没有活性的,需要在体外进行复性后才能使蛋白质具有活性。近年来,越来越多的研究表明,某些蛋白质或酶,虽然表达在包涵体中,但依然保留其活性,这种包涵体被称为活性包涵体(Active Inclusion Bodies)。与可溶性表达的酶相比,在活性包涵体中表达的酶具有很多优点,例如增加蛋白的表达量,提高蛋白质的稳定性,易于提取和纯化,并且可以重复使用等。活性包涵体中的蛋白质,是一种不可溶的聚集体,通常伴随着蛋白质构象的改变。然而,由于酶表达在活性包涵体中而导致酶的反应和底物专一性发生变化这一观点暂未被报道。为了解决这个问题,我们选择了在生物技术和工业上有广泛应用的三种酶。尿卟啉原III甲基转移酶(Uroporphyrinogen III methyltransferase,UMT),作为一种红色荧光标记,能够催化多步甲基化反应。真核生物的丝氨酸消旋酶(Serine racemase,SR),能够催化D-丝氨酸及其对映的异构体L-丝氨酸的消旋反应,以及D-和L-丝氨酸的脱水反应。人类D-氨基酸氧化酶(human D-amino acid oxidase,hDAAO)能够催化多种D-氨基酸的高效氧化。已报道,表达在包涵体中的酵母DAAO是具有活性的,目前还没有关于表达在包涵体中的UMT和SR的催化活性的报道。我们构建了可以表达为可溶的和不可溶的两种状态的三种酶,在大肠杆菌中过表达这三种酶,并且对它们的活性进行了分析。研究结果如下:1.酶的构建。无标签大麦UMT突变体UMT8是可溶性表达的,由于融合标签对荧光蛋白的催化作用几乎没有影响,我们构建了C-端融合了疏水标签ELK16的UMT8,从而降低了UMT8蛋白的可溶性表达。构建无标签玉米SR则是为了防止N或C端融合标签对玉米SR的催化活性具有潜在影响。hDAAO融合SUMO标签,可以促进蛋白的可溶性表达。所有的基因都是在T7启动子的控制下表达的。2.在大肠杆菌中过表达重组蛋白。构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。将可溶的和不可溶的目的蛋白进行分离和SDS-PAGE检测。融合ELK16的UMT8在包涵体中表达。无标签的玉米SR和融合了SUMO的hDAAO在上清和沉淀中都有表达。3.大麦UMT8蛋白可溶态和不可溶态的荧光分析。紫外光谱扫描结果显示,表达大麦UMT8的可溶性蛋白有两个吸收峰,分别是在354nm和375nm,它们是二甲基化和三基化反应的荧光产物的特异性吸收峰,相反地,表达大麦UMT8-ELK16的可溶性蛋白的这两个吸收峰明显减小,说明UMT8形成不溶性聚集体使其催化活性降低。荧光光谱扫描分析,结果显示融合ELK16标签,降低了大麦UMT8三步甲基化反应的荧光产物在细胞内的聚集,大麦UMT8蛋白的可溶性降低会抑制其催化多步甲基化反应。4.可溶态和不可溶态的玉米SR催化消旋反应和脱水反应的活性测定。可溶性表达的玉米SR同时具有消旋酶活性和脱水酶活性,而不可溶的玉米SR的脱水酶活性丧失。体外添加甘油和还原剂二硫苏糖醇(DTT),二者对两种状态的玉米SR的催化反应专一性具有不同的影响。结果说明玉米SR在活性包涵体中表达时,改变了其催化反应的特异性。5.表达在活性包涵体中的SUMO-hDAAO的产量与底物专一性分析。对融合蛋白的包涵体相对产量进行测定,28℃诱导的SUMO-hDAAO包涵体占细胞湿重的比值为17.71%;而在37℃诱导的条件下,相对比值提高到了37.99%。不可溶的hDAAO也显示出相应的氧化三种D-氨基酸的底物特异性,但可溶的和不可溶的hDAAO蛋白质之间的催化反应活性的改变略有不同,说明活性中心的轻微的构象变化是由hDAAO的不可溶表达导致的。综上所述,所选择的三种酶被有效地用作研究催化反应和底物特异性的工具酶。不可溶的玉米SR脱水酶活性的丧失,使玉米SR在生产中具有潜在的用途,被用于固定化生产D-丝氨酸。标记的不可溶的hDAAO保留了相应的底物特异性。表达在活性包涵体中的hDAAO具有容易筛选提取的特点,使其可能成为治疗帕金森病的特异性抑制剂。

关键词：活性包涵体反应专一性底物专一性大肠杆菌

定点突变改善海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷底物专一性的研究

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定点突变改善海栖热袍菌β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷底物专一性...

作者：孙慧慧南京师范大学

学位级别：硕士

黄酮类化合物(flavonoids)是植物重要的一类次生代谢产物,具有多种药物活性,如抗心血管疾病、抗肿瘤、保护肝功等。但是由于天然黄酮类化合物大部分都是以结合型的糖苷形式存在,而大多研究证明,游离的苷元形式存在的黄酮化合物的药物活... 详细信息

黄酮类化合物(flavonoids)是植物重要的一类次生代谢产物,具有多种药物活性,如抗心血管疾病、抗肿瘤、保护肝功等。但是由于天然黄酮类化合物大部分都是以结合型的糖苷形式存在,而大多研究证明,游离的苷元形式存在的黄酮化合物的药物活性要比结合型的糖苷形式高出许多,因此常通过去糖基定向修饰黄酮类化合物的分子结构以发挥其特定功能,其最常见最经济环保的修饰方法是通过酶法去掉糖基,而目前人们利用最多的酶为p-葡萄糖苷酶,但是大多数的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差,因此如何提高其对黄酮类化合物的去糖基作用是现在研究的重点。嗜热菌海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8所产的p-葡萄糖苷酶(Tm-BglA)属于水解酶家族1,具有良好的热稳定性。在前期的实验工作中,发现它能够将黄酮化合物中的结合型糖苷转化为具有更高生物活性的游离型的黄酮化合物苷元,并且对于不同的黄酮化合物底物Tm-BglA表现出的专一性不一致。为了提高Tm-BglA对黄酮化合物的底物专一性,本课题将Tm-BglA与纤维四糖进行分子对接,预测Tm-BglA的苷元结合位点,并与九种来源于不同植物、微生物的同属水解酶家族1的p-葡萄糖苷酶的氨基酸序列进行多序列比对,将位于Tm-BglA蛋白结构中第五个p-折叠股上靠近苷元结合位点的三个氨基酸(F221,N223和G224)分别进行单点突变、双点突变和三突变,对Tm-BglA进行定向改造。主要通过反向PCR的方法将分别位于221位、223位和224位上的苯丙氨酸、天冬酰胺和甘氨酸分别替换成亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸,以质粒pHsh作为载体,共构建了7个重组质粒,并转入大肠杆菌后进行纯化,比较这七个突变酶与野生型酶的酶学性质、动力学参数与黄酮化合物水解效率,分析这三个位点在Tm-BglA结构上、以及在水解黄酮化合物过程中的作用及影响,研究突变后各酶对黄酮化合物底物专一性的变化。本课题将成功构建的7个突变重组质粒转入到大肠杆菌宿主中进行表达纯化后,对其酶学性质、黄酮化合物的水解活性进行测定,与突变前的Tm-BglA进行比较,并结合分子对接对实验的结果进行分析讨论,结果表明221位、223位和224位这三个位置上的点突变不影响Tm-BglA的正常表达,对Tm-BglA的整体结构也未造成影响,没有引起Tm-BglA的最适条件、稳定性上的显著变化,但对于人工底物pNPG的动力学参数有较大影响。而点突变后,各酶对大豆异黄酮的水解活性与野生型酶相比均有不同程度的降低,对槲皮素糖苷水解活性也有不同的影响,其中含F221L点突变的突变酶与Tm-BglA相比较,对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖和槲皮素-4’-O-葡萄糖的水解活性未发生改变,含N223L点突变的突变酶对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖和槲皮素-4’-O-葡萄糖完全没有水解活性,而含G224T点突变的酶活性与Tm-BglA相比明显提高,含G224T点突变与Tm-BglA相比,对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖的转化率提高了28.6%,对槲皮素-4’-O-葡萄糖的转化率提高了35%,分析其对槲皮素-4’-O-葡萄糖的动力学参数,表明Km值降低了24%,Vmax和Kcat分别提高了68%和140%。这说明三个氨基酸位点在Tm-BglA对黄酮化合物底物专一性中起着重要作用,其中点G224尤为突出。研究结果对研究p-葡萄糖苷酶的底物专一性提供重要的理论依据,对黄酮化合物的生物转化也具有重要应用价值。

关键词： β-葡萄糖苷酶定点突变黄酮类化合物水解底物专一性

突变型环酰亚胺水解酶的分子构象与底物专一性

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突变型环酰亚胺水解酶的分子构象与底物专一性

作者：陈云霞山西大学

学位级别：硕士

环酰亚胺水解酶(Cyclic imide hydrolase，CIH，EC.3.5-2.16)，是一类报道甚少的环酰胺酶类，在细菌、真菌与霉菌中分布广泛。目前，有关CIH的报道主要有三例，分别来自于Blasterbacter sp．A17-4、Alcaligelies eatrophus 112R4和Pseudomonasputida YZ-26。其中，来源于Pseudomonas putida YZ-26的CIH293为我室专利。CIH的亚基分子量约为35 kDa，其功能单位为四聚体，它的作用底物主要是简单的环酰亚胺。CIH催化水解如琥珀酰亚胺等简单环酰亚胺类底物开环生成相应的酰胺酸，后者再在半酰胺酶的作用下生成相应的二元羧酸，最后进入TCA循环。为研究环酰亚胺水解酶(CIH293) C-端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C-末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端两个Lys替代为两个Glu或两个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE-cih为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段，并将它们分别插入到pE32M载体中，构建的重组质粒分别导入工程菌Ecoil BL21(DE3)，经诱导表达后进行菌体酶活性分析，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，CIH292、CIH291丧失约20％的活性，CIH290丧失约85％的活性，CIH289丧失全部活性;而KK292，293EE保留约80％的活性，KK292，293LL丧失90％以上的活性。根据细胞酶活性测定结果，选择CIH291、CIH290、KK292，293EE、KK292，293LL进行纯化，经Ni—NTA agarose亲和层析和Sephacryl S—200分子排阻层析获得的突变酶达到了电泳纯。重组野生型酶与突变型酶酶活性测定、寡聚体形式、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化，仍为同源四聚体;当CIH的C-末端两个Lys替代为两个Glu时，酶活性及分子结构变化均不甚明显，但当替代为两个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态。pH及热稳定性实验也表明，酶的稳定性与其分子的完整性密切相关。结果证实CIH的C-末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用。采用比色法与反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了重组野生型酶与突变型酶的底物专一性和动力学参数。通过对环酰亚胺类底物与其相应产物的紫外扫描选择了适宜监测波长，流动相采用水和甲醇的混合液作为洗脱系统，在水和甲醇按不同比例混合后，各底物与其相应产物均获得了良好的分离效果。对底物专一性的分析显示，突变型酶与重组野生型酶相比，底物专一性未发生显著改变，最适底物仍为琥珀酰亚胺;然动力学参数测定结果表明，突变型酶对最适底物的亲和力略有降低，导致反应速度减小。可见，酶活性的丧失是由于C-端残基缺失或替代影响了酶对最适底物的亲和力使反应速度降低所致。

关键词：环酰亚胺水解酶突变型酶分子构象带电荷氨基酸底物专一性