新城疫病毒La Sota株F和HN基因的克隆表达及免疫原性分析

作     者：符芳 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高轩

授予年度：2006年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新城疫病毒(NDV) La Sota株 F基因 HN基因 原核表达 免疫原性 

摘      要：新城疫是危害养禽业的主要疾病之一。近年来,新城疫的爆发出现了许多新特点,免疫失败报道增多,甚至抗体水平较高的鸡群也时常发病。为控制新城疫的爆发,急需研制基因工程苗。 以本实验室保存的NDV LaSota株全基因作为模板,根据Genbank已经发表的序列设计两对引物,采用RT-PCR技术人工扩增出了NDV LaSota株F、HN基因,分别将其克隆到PGEM-T easy载体中,再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到的转化子经分子量比较、PCR鉴定和酶切分析筛选阳性克隆。结果表明,作者得到的阳性重组子(PGEM-F、PGEM-HN)中含有F和HN基因,且是正确插入到载体中的。F基因的测序结果与B1、V4、Roakin、JS06、F48E9毒株的基因序列相比,核苷酸序列同源性为84.7%-99.9%,氨基酸同源性为88.1%-99.6%;HN基因的测序结果与B1、V4、Roakin、YG、F48E9毒株相比,核苷酸序列同源性为82.5%-99.6%,氨基酸同源性为88.1%-99.9%。 然后将克隆化F、HN基因亚克隆到PET-32a(+)载体上,得到的转化子经PCR鉴定和酶切分析,筛选出符合阅读框的重组子,构建成重组表达质粒PET-F、PET-HN,再将重组表达质粒转化进宿主菌BL(DE3),在IPTG诱导下表达出约为83kd和86kd的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测证实上述两段基因片段均获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。 在优化了表达条件后,对重组蛋白进行了大量表达并纯化,用于免疫六周龄雄性昆明小鼠,免疫小鼠均产生较高的抗体水平。由此表明,体外表达的重组蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。本研究为进一步研究以上两个功能区的生物学活性及在不同毒株中共同的抗原表位奠定基础,也为研究基因工程疫苗创造了一定的条件。