补肾活血汤调控OPG/RANKL/RANK信号通路对激素性股骨头缺血坏死成骨与破骨的影响

作     者：陈汉尧 

作者单位：福建中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：齐振熙

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：股骨头缺血坏死 补肾活血汤 OPG RANKL TRAF-6 

摘      要：目的通过观察补肾活血汤对SD大鼠激素性股骨头缺血坏死OPG/RANKL/RANK信号通路的影响,以探讨补肾活血汤对SD大鼠激素性股骨头缺血坏死OPG/RANKL/RANK信号通路的作用机制,阐释中医补肾壮骨、活血化瘀防治SANFH作用机理,探讨补肾活血汤治疗SANFH的疗效。方法1.成年SD大鼠64只,采用随机数字表法分组,分为空白对照组14只,造模组50只,造模组采用脂多糖联合激素造模方法造模。正常组注射相同剂量相同频次的生理盐水。6周后,空白对照组和模型组各随机抽取2只,10%水合氯醛腹腔注射,在麻醉后取出新鲜的SD大鼠股骨头组织行组织形态学检测,验证造模结果。2.造模成功后按人与大鼠体表面积用药量的换算,计算出每只大鼠所需的剂量,补肾活血汤高、中、低剂量治疗组给予含生药浓度分别为2.5g/kg、5g/kg、10g/kg的补肾活血汤灌胃,每天早晚各1次;正常组和模型组在第7～10周,以5g/kg/d的生理盐水灌胃,每天早晚各1次。用含生药浓度为1.0g/ml补肾活血汤制剂计算,低剂量治疗组灌胃剂量为2.5ml/kg,中剂量治疗组灌胃剂量为5ml/kg,高剂量治疗组灌胃剂量为10ml/kg。3.上述五组,经腹腔动脉采血,取血清,检测各组大鼠血清ALP含量;取双侧股骨头光镜下观察股骨头骨组织变化情况;采用蛋白免疫杂交技术,检测SD大鼠股骨头中RANKL、TRAF-6的表达,采用免疫组化检测股骨头OPG表达。结果1.小剂量脂多糖联合激素造模方法坏死率高,模型可见大片云片状的坏死细胞,潮线不连续甚至撕裂;骨小梁断裂,坏死消失,空骨陷窝率为32.48±2.43,动物死亡率低(3.125%),造模周期短,造模的用药方法与临床患者更加贴近。2.血清LAP检测：高剂量补肾活血汤能有效提高大鼠体内血清LAP含量,经高剂量的补肾活血汤灌胃的SD大鼠股骨头软骨层可新生类骨质的结缔组织,骨小梁基本连续,坏死明显低于中低剂量治疗组和模型组,具有较好的成骨作用。3.股骨头OPG免疫组化染色表达检测：补肾活血汤灌胃的大鼠股骨头内OPG表达高于模型组,差异具有统计学意义;高剂量补肾活血汤灌胃组OPG免疫组化染色平均吸光度明显及阳性表达率高于中、低剂量治疗组,差异具有统计学意义。表明补肾活血汤具有成骨作用,高剂量的补肾活血汤疗效最佳。4.股骨头RANKL、TRAF-6蛋白免疫印记表检测：补肾活血汤灌胃的大鼠股骨头内RANKL、TRAF-6表达低于模型组,差异具有统计学意义;高剂量补肾活血汤灌胃组RANKL、TRAF-6阳性表达低于中、低剂量治疗组,差异具有统计学意义。表明补肾活血汤具有抑制股骨头破骨因子RANKL、TRAF-6表达作用,高剂量的补肾活血汤疗效最佳。结论1.小剂量脂多糖联合激素造模方法坏死率高,动物死亡率低,造模周期短,造模的用药方法与临床患者更加贴近,是有效的造模方法。2.高剂量补肾活血汤能有效提高大鼠体内血清LAP含量,高剂量的补肾活血汤灌胃的SD大鼠股骨头坏死明显低于中低剂量治疗组和模型组,具有较好的成骨作用。3.补肾活血汤能增强OPG的表达,具有成骨作用,高剂量的补肾活血汤疗效最佳;补肾活血汤具有抑制股骨头破骨因子RANKL、TRAF-6表达作用,高剂量的补肾活血汤疗效最佳。