HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

作     者：舒雄 刘辉琦 杰永生 郑蕊 綦惠 陈磊 靳少锋 冉宇靓 Shu Xiong;Liu Huiqi;Jie Yongsheng;Zheng Rui;Qi Hui;Chen Lei;Jin Shaofeng;Ran Yuliang

作者机构：北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所北京100035 青海大学青海西宁810016 国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院北京100021 

出 版 物：《现代肿瘤医学》 (Journal of Modern Oncology)

年 卷 期：2020年第28卷第7期

页      面：1057-1062页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：中国医学科学院医学与健康科技创新工程(编号:2016-I2M-3-013 2017-I2M-3-005) 

主　　题：骨肉瘤细胞 HSP90β 慢病毒载体 RNA干扰 过表达 

摘      要：目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR与Western blotting分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2. 8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,p EZ-HSP90β组较NEG-p EZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。