MLH1R217C/BRAFV600E突变型家族性甲状腺乳头状癌永生化细胞系的建立及鉴定

作     者：郝伟静 于洋 王青松 赵丽 叶艳 董莉 李健森 孟祥睿 运新伟 高明 HAO Weijing;YU Yang;WANG Qingsong;ZHAO Li;YE Yan;DONG Li;LI Jiansen;MENG Xiangrui;YUN Xinwei;GAO Ming

作者机构：天津医科大学肿瘤医院甲状腺颈部肿瘤科、国家肿瘤临床医学研究中心天津市“肿瘤防治”重点实验室300060 天津医科大学基础医学研究中心 天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系 天津医科大学 天津医科大学肿瘤医院、国家肿瘤临床医学研究中心 

出 版 物：《天津医药》 (Tianjin Medical Journal)

年 卷 期：2016年第44卷第6期

页      面：657-661,803页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81272282) 

主　　题：甲状腺肿瘤 细胞系,肿瘤 细胞培养技术 家族性甲状腺乳头状癌 永生化细胞系 原代培养 MLH1 BRAF 

摘      要：目的建立家族性甲状腺乳头状癌(FPTC)永生化细胞系,为研究家族性非髓样甲状腺癌(FNMTC)提供新的途径。方法选取FPTC患者的肿瘤标本,采用消化法分离原代细胞。使用改良的DMEM/F12培养基,添加促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、表皮细胞生长因子(EGF)及氢化可的松等进行培养。在原代细胞早期分2种方式导入外源基因SV40T/TERT用于诱导永生化。利用RT-PCR检测甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、促甲状腺激素受体(TSHR)、钠/碘共同转运体(NIS)等基因的表达,同时利用免疫荧光技术检测TPO及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白的表达。提取该患者外周血DNA,进行突变基因的检测。提取细胞基因组PCR扩增后测序,进行突变基因的检测。结果分离的FPTC原代细胞呈梭形或不规则多角形贴壁生长;细胞生长6个月,转染SV40T组(标记为FPTC-S)传代至p26,FPTC细胞传代至p23,转染SV40T+h TERT组(标记为FPTC-ST)传代至p19,细胞增殖能力较好;FPTC-S与FPTC-ST细胞均能够在基因水平稳定表达TPO、TG与TSHR;患者外周血中存在MLH1 R217C胚系突变;原代细胞存在BRAF V600E突变;原代细胞及永生化的细胞系中均存在MLH1 R217基因突变。结论本研究初步建立了FPTC永生化细胞系,且该细胞系中存在MLH1 R217C及BRAF V600E突变,该细胞系将为研究以上突变及其相互作用关系提供研究模型。