茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

作     者：史成颖 李正国 徐乾 李海婧 汤之近 邓威威 宛晓春 SHI Chengying;LI Zhengguo;XU Qian;LI Haijing;TANG Zhijin;DENG Weiwei;WAN Xiaochun

作者机构：安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室合肥230036 

出 版 物：《西北植物学报》 (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica)

年 卷 期：2017年第37卷第1期

页      面：40-47页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(31170283 31300576) 

主　　题：茶树 谷氨酰胺 茶氨酸 基因克隆 原核表达 酵母表达 酶活性 

摘      要：在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.***.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。