大口黑鲈G6pc和Gck的原核表达、抗体制备及饲料淀粉水平对其表达的影响

作     者：夏如 孙皓 王康伟 莫丁瑞 黄正 何远法 林仕梅 陈拥军 XIA Ru;SUN Hao;WANG Kang-Wei;MO Ding-Rui;HUANG Zheng;HE Yuan-Fa;LIN Shi-Mei;CHEN Yong-Jun

作者机构：西南大学水产学院水产科学重庆市市级重点实验室淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室北碚400715 

出 版 物：《水生生物学报》 (Acta Hydrobiologica Sinica)

年 卷 期：2024年第48卷第11期

页      面：1835-1844页

核心收录：

学科分类：090801[农学-水产养殖] 0908[农学-水产] 09[农学] 

基　　金：重庆市生态渔产业技术体系(2022) 西南大学研究生科研创新项目(SWUS23141)资助 

主　　题：葡萄糖-6-磷酸酶 葡萄糖激酶 原核表达 多克隆抗体 大口黑鲈 

摘      要：为深入研究营养因子调控大口黑鲈(Micropterus salmoides)葡萄糖稳态的分子机制,研究成功克隆并构建了大口黑鲈葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6pc)和葡萄糖激酶(Gck)截短序列的重组质粒载体,转化至Escherichia coli Rosetta感受态细胞并以1 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、16℃诱导表达过夜,在细胞破碎后的上清中得到了大量表达。通过GST-tag亲和层析的方法纯化得到高纯度的G6pc和Gck截短重组蛋白后,将其分别与弗氏佐剂乳化成免疫原,免疫KM小鼠5次,成功制备具有高特异性和高效价的多克隆抗体(G6pc和Gck抗体的效价分别大于1﹕3000和1﹕10000)。Westen blot检测发现大口黑鲈G6pc和Gck蛋白主要分布在肝脏中,免疫荧光染色显示G6pc的阳性信号定位于细胞核周围,而Gck的阳性信号散布整个细胞。在8周养殖实验结束后,随饲料淀粉水平以6%的梯度从8%增加到20%,大口黑鲈肝脏中糖酵解和糖原合成关键酶编码基因的表达及Gck水平逐渐升高,但糖异生和糖原分解关键酶编码基因的表达及G6pc水平仅在14%淀粉水平时被抑制,意味着在高淀粉水平(20%)下大口黑鲈肝脏中葡萄糖-G6P间的相互转化发生了无效循环。综上所述,研究成功制备了大口黑鲈G6pc和Gck特异性识别的多克隆抗体,探明了饲料淀粉水平对其表达的影响,为深入研究G6pc和Gck在大口黑鲈葡萄糖稳态维持过程中的重要作用奠定了基础。