基于慢病毒包装构建稳定表达Cas9蛋白的Caco-2细胞系

作     者：王铭月 刘欣奕 张锦华 章青 王宏 孔翔羽 孙晓曼 庞立丽 李丹地 段招军 

作者机构：甘肃中医药大学公共卫生学院 传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 大连医科大学附属第二医院 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFC2301000) 

主　　题：Cas9蛋白 Caco-2细胞 基因敲除 成簇的规律性间隔短回文重复序列 

摘      要：目的 采用成簇的规律性间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统构建基因敲除细胞文库，以人结肠腺癌细胞Caco-2为研究对象构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系。方法 包装重组Cas9慢病毒并感染Caco-2细胞，经杀稻瘟菌素及2次有限稀释法筛选Caco-2/Cas9单克隆细胞，并进行PCR和Western blot鉴定。用同时表达GFP和带有GFP向导RNA(single guide RNA,sgRNA)的慢病毒感染Caco-2/Cas9单克隆细胞，经嘌呤霉素筛选后，采用流式细胞术检测结果计算Caco-2细胞株的敲除效率，CCK-8法检测其细胞增殖活性。结果 共获得5株Caco-2/Cas9单克隆细胞系，分别命名为Caco-2/Cas9-2、Caco-2/Cas9-3、Caco-2/Cas9-4、Caco-2/Cas9-5和Caco-2/Cas9-6，均可扩增出392 bp的Cas9基因条带，Cas9蛋白在细胞中稳定表达，敲除效率分别为91.27%、20.30%、24.13%、11.33%、12.27%、8.89%;Caco-2/Cas9-4、Caco-2/Cas9-5、Caco-2/Cas9-6 3株单克隆细胞及未感染Caco-2细胞的增殖活性分别为2.07、1.75、1.46和1.40。Caco-2/Cas9-5、Caco-2/Cas9-6单克隆细胞与未感染Caco-2细胞比较，差异均无统计学意义（t分别为1.92和0.37,P均 0.05）。结论 筛选出1株具有Cas9高酶切活性且细胞增殖活性较未感染Caco-2细胞无显著变化的Caco-2/Cas9单克隆细胞系，即Caco-2/Cas9-6单克隆细胞，为进一步构建高覆盖率敲除细胞文库奠定了基础，也为筛选病毒感染有关基因和其他特定功能基因提供了平台。