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完全基于质粒的轮状病毒反向遗传技术进展

病毒学报 2024年第4期40卷 897-906页

作者：余俊杰刘夏飞李杉段招军甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000 河南中医药大学第一临床医学院郑州450046 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

人轮状病毒(Rotavirus,RV)为双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是全球5岁以下婴幼儿重症腹泻的主要病因。2017年,完全基于质粒的轮状病毒反向遗传技术获得成功,此后被不断改进。该技术可成功获得体外人工改造的特定表型的轮状病... 详细信息

人轮状病毒(Rotavirus,RV)为双链RNA病毒,属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是全球5岁以下婴幼儿重症腹泻的主要病因。2017年,完全基于质粒的轮状病毒反向遗传技术获得成功,此后被不断改进。该技术可成功获得体外人工改造的特定表型的轮状病毒,促进和丰富了轮状病毒感染致病机制研究以及新一代轮状病毒疫苗、药物等干预手段的开发。本文将概述和比较已报道的不同轮状病毒反向遗传技术特征,以期推动我国轮状病毒反向遗传技术体系的建立,促进我国轮状病毒的科学研究及预防控制。

关键词：轮状病毒病毒感染反向遗传

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融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

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病毒学报 2024年第2期40卷 225-232页

作者：毛彤瑶张鹏姜苏芮李丹地段招军传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝... 详细信息

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10^(11)IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现:AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得融合表达SARS-CoV-2 Omicron突变株S1-N蛋白的高滴度重组腺病毒,该重组病毒能在小鼠诱导针对S1和N蛋白的特异性免疫应答,为后续深入研究和评价该候选疫苗奠定了基础。

关键词：新型冠状病毒腺病毒载体疫苗体液免疫融合表达

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对两株NSP3区插入外源基因的重组轮状病毒遗传稳定性的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2024年第1期38卷 1-6页

作者：李杉刘夏飞余俊杰李丹地段招军甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000 河南中医药大学第一临床医学院郑州450046 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

目的分析2株插入和表达外源基因的重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD在MA104细胞上连续传代增殖的遗传稳定性。方法将2株重组轮状病毒滴度测定后, 按照MOI0.01传至P2代, 随后按1∶100稀释并活化上一代病毒裂解液, 连续18... 详细信息

目的分析2株插入和表达外源基因的重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD在MA104细胞上连续传代增殖的遗传稳定性。方法将2株重组轮状病毒滴度测定后, 按照MOI0.01传至P2代, 随后按1∶100稀释并活化上一代病毒裂解液, 连续18代(P20)感染MA104细胞, 用间接免疫荧光法测定P1, P5, P10, P15, P20代细胞裂解液病毒滴度, 进行RT-PCR鉴定以及dsRNA-PAGE银染实验, 并检测rLLR/NSP3-NLuc的荧光素酶活性。结果重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc在20代内均未发现插入片段丢失, 重组病毒滴度为3.85~5.16×10^(6) FFU/ml, 各代次均有较强的荧光素酶信号。重组轮状病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD在第6代出现了插入片段的丢失, 该重组病毒前5代的感染性滴度为:2.6~3.36×10^(6) FFU/ml。结论 NSP3基因末端插入582 bp NLuc的重组轮状病毒具有很好的遗传稳定性, 而NSP3基因末端插入885 bp RBD的重组轮状病毒仅在前5代稳定, 提示重组轮状病毒NSP3基因末端可以插入和表达外源基因, 但其稳定性需要更深入研究。

关键词：重组轮状病毒 MA104细胞遗传稳定性

儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识（2024年版）

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中国疫苗和免疫 2024年第1期 95-126页

作者：段招军李金松张静邓莉赵鲁卿李丹地李静欣轮状病毒胃肠炎专家共识编写组中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京中医医院首都儿科研究所

轮状病毒胃肠炎(Rotavirus gastroenteritis, RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重，防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场... 详细信息

轮状病毒胃肠炎(Rotavirus gastroenteritis, RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重，防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场文件—2021年7月》的基础上，系统综述了RVGE流行病学、已上市轮状病毒(Rotavirus, RV)疫苗的安全性、有效性和免疫保护持久性、RV疫苗免疫策略等国内外研究进展，增补了常见的RVGE诊疗方案。本共识旨在从预防为主和医防融合的角度出发，推动落实以疫苗接种为重点的RVGE综合性防控措施，降低儿童RVGE疾病负担，为从事疾病预防控制、疫苗接种、临床诊疗等多领域的工作人员提供参考。

关键词：轮状病毒胃肠炎轮状病毒疫苗免疫预防共识

人GⅡ.14诺如病毒VLP抗原性及组织血型抗原结合特征

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病毒学报 2024年第4期40卷 705-715页

作者：欧阳瑄泽柴鹏弟宋敬东靳淼李利利李金松孙晓曼段招军甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730020 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

本研究旨在制备人GⅡ.14诺如病毒的(Norovirus,NoV)病毒样颗粒(Virus⁃like particle,VLP),探索其抗原性与组织血型抗原结合的特征。利用杆状病毒系统表达人GⅡ.14 NoV VP1蛋白,通过超速离心和分子筛层析纯化VLP;将VLP免疫动物制备兔多... 详细信息

本研究旨在制备人GⅡ.14诺如病毒的(Norovirus,NoV)病毒样颗粒(Virus⁃like particle,VLP),探索其抗原性与组织血型抗原结合的特征。利用杆状病毒系统表达人GⅡ.14 NoV VP1蛋白,通过超速离心和分子筛层析纯化VLP;将VLP免疫动物制备兔多抗血清,通过免疫印迹(Western blot,WB)、酶联免疫吸附(ELISA)进行抗原性评价及多抗功能验证;利用唾液结合实验检测人GⅡ.14 VLP的糖结合特征;通过蛋白序列及结构比较分析GⅡ.14 P蛋白潜在的糖结合位。纯化获得人GⅡ.14 VP1蛋白,电镜观察显示可以形成结构较为均一的VLP;制备的兔多抗能与GⅡ.14 VLP特异性结合,与检测的其他基因型VLP没有交叉反应;唾液结合实验表明GⅡ.14 VLP与人A/B/O/AB型别唾液都有较好的结合;序列和结构分析显示GⅡ.14 P蛋白模拟结构与GⅡ.9最为接近,具有与GⅡ.9以及流行株GⅡ.4等相似的潜在糖结合区。本研究表明GⅡ.14具有较为广泛的唾液结合特性,通过序列比对和结构学方法分析了GⅡ.14潜在的受体结合机制,为不同型别NoVs的流行监测提供了更多依据。

关键词：诺如病毒病毒样颗粒组织血型抗原

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儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2024年版)

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中华预防医学杂志 2024年第4期58卷 421-453页

作者：儿童轮状病毒胃肠炎专家共识编写组段招军李金松张静邓莉赵鲁卿李丹地李静欣不详传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室、国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 中国疾病预防控制中心首都儿科研究所北京中医医院

轮状病毒胃肠炎(RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重,防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场文件-2021年7月》的基础上,系... 详细信息

轮状病毒胃肠炎(RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重,防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场文件-2021年7月》的基础上,系统阐述了RVGE流行病学、已上市轮状病毒(RV)疫苗的安全性、有效性和免疫保护持久性、RV疫苗免疫策略等国内外研究进展,增补了常见的RVGE诊疗方案。本共识旨在从预防为主和医防融合的角度出发,推动落实以疫苗接种为重点的RVGE综合性防控措施,降低儿童RVGE疾病负担,为从事疾病预防控制、疫苗接种、临床诊疗等多领域的工作人员提供参考。

关键词：轮状病毒胃肠炎轮状病毒疫苗免疫预防共识

利用反向遗传技术产生表达外源基因的重组SA11轮状病毒

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中国人兽共患病学报 2024年第2期40卷 140-146页

作者：柴萨萨蔡昊刘夏飞赵静宋敬东李金松裴银辉李利利段招军华北理工大学基础医学院河北省慢性疾病基础医学重点实验室唐山063000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206 甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增... 详细信息

目的利用反向遗传技术产生NSP1基因插入和表达外源基因的重组SA11轮状病毒,构建可表达外源基因的轮状病毒载体。方法本研究将轮状病毒SA11株的NSP1基因片段的223位(5端)至1388位的核苷酸删除,并直接插入连接了终止-再启动元件(P2A)的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因,采用已建立的“12质粒”轮状病毒反向遗传系统拯救NSP1基因插入和表达EGFP的重组SA11轮状病毒。通过观察细胞病变效应和插入基因(EGFP)的荧光表达初步确定重组病毒的成功拯救,再结合电镜的形态学观察、RT-PCR的测序结果及病毒基因组的检测结果,进一步证明重组轮状病毒的成功拯救和传代扩增。利用TCID 50法和qRT-PCR法,测定了rSA11和rSA11/NSP1-EGFP的病毒滴度并绘制了基因组复制动力曲线。结果基于“12质粒系统”成功拯救了重组轮状病毒rSA11/NSP1-EGFP,证明NSP1片段截短并插入外源基因后病毒仍可正常复制,且具有良好的遗传稳定性,但病毒滴度低于其亲本株。结论基于NSP1基因插入和表达EGFP的重组轮状病毒能够实现稳定遗传,为利用反向遗传学构建表达外源基因的轮状病毒载体的深入探索提供了基础。

关键词： A组轮状病毒反向遗传外源基因 NSP1基因

儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2024年版)

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中国疫苗和免疫 2024年第1期30卷 95-126页

作者：轮状病毒胃肠炎专家共识编写组段招军李金松张静邓莉赵鲁卿李丹地李静欣不详传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室、国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中国疾病预防控制中心首都儿科研究所北京中医医院

轮状病毒胃肠炎(Rotavirus gastroenteritis,RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重,防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场文... 详细信息

轮状病毒胃肠炎(Rotavirus gastroenteritis,RVGE)是严重威胁5岁以下儿童健康的全球性公共卫生问题。中国RVGE相关疾病负担重,防控难度大。本共识在《儿童轮状病毒胃肠炎免疫预防专家共识(2020版)》和《世界卫生组织轮状病毒疫苗立场文件—2021年7月》的基础上,系统综述了RVGE流行病学、已上市轮状病毒(Rotavirus,RV)疫苗的安全性、有效性和免疫保护持久性、RV疫苗免疫策略等国内外研究进展,增补了常见的RVGE诊疗方案。本共识旨在从预防为主和医防融合的角度出发,推动落实以疫苗接种为重点的RVGE综合性防控措施,降低儿童RVGE疾病负担,为从事疾病预防控制、疫苗接种、临床诊疗等多领域的工作人员提供参考。

关键词：轮状病毒胃肠炎轮状病毒疫苗免疫预防共识

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G6P[1]型牛轮状病毒的分离培养及鉴定

中国人兽共患病学报 2024年第2期40卷 134-139页

作者：王铭月张锦华章青孔翔羽王宏孙晓曼李丹地庞立丽段招军甘肃中医药大学公共卫生学院兰州730000 传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

目的从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定。方法用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(... 详细信息

目的从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定。方法用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对样本VP4和VP7基因进行扩增和测序,与GenBank上的参考序列进行同源性分析,构建进化树,分析确定其G/P基因分型。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Polyacrylamine Gel Electrophoresis,PAGE)、噬斑实验和电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等技术对分离到的病毒进行鉴定和纯化。绘制病毒生长动力学曲线。结果分离培养了1株BRV毒株,将其命名BLL。VP7和VP4基因测序结果显示此毒株为G6P[1]型轮状病毒。PAGE胶结果显示分离株电泳型为长型,条带呈现A组轮状病毒排列电泳图谱;通过噬斑实验将毒株进行了纯化。电镜检测到典型的轮状病毒颗粒。病毒生长动力学曲线可发现病毒在感染后6 h已经开始复制。结论本研究成功分离到G6P[1]型牛型轮状病毒,为研究G6P[1]型轮状病毒的病原学特征提供实验基础和技术参考。

关键词：轮状病毒 G6P 分离噬斑实验纯化序列分析