NOX4调控神经细胞增殖在神经管缺损发生中的作用

作     者：付佳琳 黄琬淇 黄天楚 顾卉 袁正伟 Fu Jialin;Huang Wanqi;Huang Tianchu;Gu Hui;Yuan Zhengwei

作者机构：中国医科大学附属盛京医院卫生部小儿先天畸形重点实验室沈阳110004 

出 版 物：《中华小儿外科杂志》 (Chinese Journal of Pediatric Surgery)

年 卷 期：2023年第44卷第3期

页      面：252-258页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81771595) 国家重点研发计划(2016YFC1000505) 

主　　题：神经管缺损 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 细胞增殖 

摘      要：目的探究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)通过调控细胞增殖对小鼠神经管缺损(neural tube defects,NTDs)形成的作用。方法选用体重18~20 g的健康C57BL/6J小鼠,雌鼠30只,雄鼠15只,雌雄小鼠按2∶1比例于晚上合笼、过夜,次日清晨观察小鼠阴道栓,有明显阴道栓确认已交配,当日记为孕0.5 d(E0.5)。选取明确受孕的18只小鼠,按随机数字表法随机分为小鼠NTDs组(9只)和对照组(9只)。孕8.5 d(E8.5)时,将小鼠NTDs组利用全反式维甲酸(all trans retinoid acid,ATRA)按70 mg/kg的浓度灌胃处理,对照组采用橄榄油灌胃处理。在孕9.5 d(E9.5)收集胎鼠。体式显微镜下观察胚胎神经管发育情况并拍照记录形态。通过免疫荧光染色法观察神经管形态,蛋白质印迹法(Western blot)检测NOX4和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在神经管的表达情况。构建NOX4过表达质粒(oe-NOX4)和对照(NC)以及NOX4沉默质粒(sh-NOX42^(#)、sh-NOX43^(#))和对照(sh-NC),分别转染至C17.2细胞系中,通过Western blot检测NOX4及增殖相关蛋白PCNA的表达情况;通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测转染质粒24 h、48 h、72 h、96 h后细胞生长情况,进一步明确NOX4对细胞增殖的调控作用。结果体式显微镜下观察E9.5胎鼠神经管发育情况,NTDs组存在明显神经管畸形。免疫荧光染色结果也显示NTDs组存在明显的神经管闭合不全,对照组神经管发育正常,且NTDs组神经管中NOX4表达略高于对照组,而PCNA的表达低于对照组。Western blot结果显示,NTDs组胚胎中NOX4表达(6.24±2.70)高于对照组(1.00±0.51),PCNA的表达(0.75±0.09)低于对照组(1.00±0.12),两组间的差异有统计学意义(P0.05)。在C17.2神经干细胞中转染NOX4过表达质粒(oe-NOX4)和沉默质粒(sh-NOX42^(#)、sh-NOX43^(#)),利用Western blot检测NOX4表达水平的变化,结果显示,转染oe-NOX4质粒后,NOX4的表达(1.26±0.13)显著高于转染NC组(1.00±0.02),而转染oe-NOX4质粒后增殖相关蛋白PCNA的表达(0.71±0.10)较NC组(1.00±0.12)显著降低,差异有统计学意义(P0.05);相反,转染sh-NOX42^(#)、sh-NOX43^(#)质粒后,NOX4的表达为(0.85±0.06)、(0.71±0.06),显著低于转染sh-NC质粒组(1.00±0.04),PCNA的表达(1.61±0.17)、(1.43±0.17)较sh-NC组(1.00±0.17)明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。利用CCK8实验探究NOX4对细胞增殖能力的影响,结果提示,过表达NOX4,24 h后与NC组相比,吸光度为(0.48±0.01)比(0.48±0.02),48 h为(0.82±0.04)比(1.12±0.03),72 h为(1.07±0.10)比(2.10±0.10),96 h为(2.53±0.20)比(3.01±0.43),细胞增殖能力呈下降趋势,差异有统计学意义(P0.05);而与sh-NC相比,当转染sh-NOX42^(#)、sh-NOX43^(#),24 h吸光度分别为(0.32±0.02)、(0.31±0.02)、(0.30±0.01),48 h为(0.77±0.02)、(0.64±0.04)、(0.37±0.04),72 h为(1.94±0.05)、(1.69±0.03)、(1.24±0.08),96 h为(2.33±0.11)、(2.11±0.05)、(2.01±0.01),细胞增殖能力有显著提高,差异有统计学意义(P0.05)。结论NTDs中异常高表达的NOX4能够通过降低增殖相关蛋白PCNA的表达,抑制细胞增殖,导致小鼠神经管闭合异常。