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L-赖氨酸生产的氮源和生长因子替代与发酵条件优化

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L-赖氨酸生产的氮源和生长因子替代与发酵条件优化

作者：金永红吉林大学

学位级别：硕士

L-赖氨酸是脂肪族碱性氨基酸一种，化学名称是2,6-二氨基已酸，是人、动物生长发育所需的八种必需氨基酸（它们是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸及色氨酸）之一。是谷物蛋白第一限制氨基酸，在谷物食料中... 详细信息

L-赖氨酸是脂肪族碱性氨基酸一种，化学名称是2,6-二氨基已酸，是人、动物生长发育所需的八种必需氨基酸（它们是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸及色氨酸）之一。是谷物蛋白第一限制氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的生物价会提高很多，它是人和动物体内是自身不能合成的物质，必须从日常食物或者外界中摄取，赖氨酸是帮助其它营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质,人体只有补充了足够的L-赖氨酸才能提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，对促进生物健康生长发育有着特殊重要意义、起着不可或缺的作用。全球约90%的赖氨酸用作饲料添加剂，约5%用作食品添加剂。目前国内外L-赖氨酸获取主要以微生物发酵方法生产，即以玉米淀粉乳制液体葡萄糖或结晶葡萄糖为主要原料，由特定微生物菌种在一定配方培养基及适宜培养控制条件下经生物发酵后提取、精制后获得。国内外生产赖氨酸企业普遍以硫酸铵、液氨、毛发粉（毛发氨基酸）作为氮源、及以玉米浆、糖蜜作为辅助氮源、生长因子。但毛发粉在投料使用过程中，会让人产生不适，并产生气味，且部分生产毛发粉厂家产品会有重金属超标现象，在生产中，使用的综合性价比也要低于玉米浆，自制液体葡萄糖来自玉米淀粉乳，而玉米浆是由加工玉米淀粉乳中的玉米浸泡液浓缩后获得，通过管线供应，方便企业使用。综上所述，尽量在赖氨酸发酵培养过程中减少或不使用毛发粉作为培养基，已经成为发酵培养基优化的重要研究内容与方向。甜菜碱作为新型培养基，现已大批使用在氨基酸（谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸）发酵培养过程中，甜菜碱是一种从甜菜中发现的生物碱，其分子式为C5H11NO2。主要有维持细胞对酶的保护作用、抗盐持久性等特殊效应。甜菜碱盐酸盐中含有赖氨酸发酵所需大量生长因子，因来自甜菜提取物，并经过精制，所以添加效果要强于甜菜糖蜜，生化反应过程中甜菜碱盐酸盐作为甲基供体提供活性甲基，高半胱氨酸转变为蛋氨酸的过程，能够减少配料中蛋氨酸的添加，有利于降低生产成本。甜菜碱能够保护微生物避免受渗透压激变的影响提高了微生物的成活率，而且甜菜碱与很多催化生物酶具有很好的兼容性，甜菜碱有如此之多好处，引起氨基酸发酵行业人士高度关注，甜菜碱已成为氨基酸发酵的产酸促进剂，成为发酵行业研究的最新课题。具体研究如下： 1、种子罐培养基优化以赖氨酸菌（黄色短杆菌）为生长菌，研究确定菌种在种子罐快速生长，保持菌种活力，缩短培养时间的氮源配方比例。在种子罐培养基中减少或不添加毛发粉后，因氮源配比数量减少，根据菌种生产需要适当增加其它氮源，我们以玉米浆作为补充，调高玉米浆比例以补充毛发粉减少量。通过试验确定种子罐配料可以不使用毛发粉，增加玉米浆的配料比例，将玉米浆配料比例提高到9%，可实现种子罐OD值快速生长，效果基本与添加毛发粉一致，并缩短培养时间。 2、发酵罐培养基优化在发酵罐培养中，当菌种繁殖到一定程度，需代谢赖氨酸。因此我们着力研究经济而环保的培养基原材料。试验生产不使用毛发粉，提高玉米浆在培养基中比例到3.1%，不使用甜菜糖蜜，提高甜菜碱在培养基中比例到0.32%，减少蛋氨酸在培养基中的比例，将蛋氨酸添加量降低到0.013%，调整并优化培养基成分，在发酵罐培养中用苏氨酸生产离心工序中产生的母液代替商品苏氨酸用在配料中，节省商品苏氨酸的使用量，商品苏氨酸是固体，而苏氨酸母液是液体，使用苏氨酸母液不但降低了包装与干燥成本，并消化处理了苏氨酸母液，苏氨酸母液未加入发酵时，经常回配系统，增加处理成本。在发酵培养控制中，原补料时用双酶法制葡萄糖，现试验用结晶糖母液按一定比例与葡萄糖液混合用做发酵碳源，减少了液体葡萄糖的使用量，并消化过理了难已处理的结晶糖母液，实现了培养基的原料的综合利用，发酵结束放罐产酸率在18.5g/dl-19.2g/dl,糖酸转化率达到68-70%，分别较原有培养基：发酵产酸率提高0.04g/dl,转化率提高2%，缩短培养时间4hr、达到了减少能源消耗，降低生产成本的目的。并减轻环保压力，达到了降低生产成本的目

关键词： L-赖氨酸产酸率转化率玉米浆甜菜碱

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双功能抗氧化酶的设计与研究

双功能抗氧化酶的设计与研究

作者：宗慧吉林大学

学位级别：硕士

活性氧（ROS）作为氧代谢的副产物，能够引起生物体中蛋白质及核酸的损伤，生物体针对ROS已经建立了一套完整的防御体系，在正常情况下，ROS的产生和清除处于平衡状态，但当出现氧化应激现象，即产生的ROS无法被及时清除时，就会引起生... 详细信息

活性氧（ROS）作为氧代谢的副产物，能够引起生物体中蛋白质及核酸的损伤，生物体针对ROS已经建立了一套完整的防御体系，在正常情况下，ROS的产生和清除处于平衡状态，但当出现氧化应激现象，即产生的ROS无法被及时清除时，就会引起生物体的氧化损伤，此外，ROS的过量积累会引发多种疾病，甚至是癌症。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）作为生物体三大抗氧化酶之一，能够利用谷胱甘肽（GSH）清除氢过氧化物，天然GPX的结构、功能及催化机制已经为大家所熟知，但是由于天然GPX分子量较大，会引起人体的免疫反应，所以临床应用困难。此外，天然GPX来源有限，稳定性差等缺点为其开发利用带来了更大的困难，因此对GPX的人工模拟就受到越来越多的关注。一、具有清除羟自由基能力的GPX模拟物前期研究发现，GPX的天然底物GSH能与β-环糊精（β-CD）分子结构中的疏水空腔发生分子识别，并能够很好的进入该空腔，同时Diego等发现咪唑基取代的环糊精分子具有清除羟自由基（·OH）的能力。基于以上两点，我们以β-CD为骨架，在其分子结构中两个相邻糖环的2-OH处分别引入GPX的催化原子—硒（Se）和咪唑（Im），最后通过空气氧化得到具有硒桥结构的2-ImSeCD。该分子具有较好的GPX活力，催化机制与天然GPX相同，此外，通过Fenton/Rh-B体系检测其清除·OH的能力，发现Fenton反应产生的·OH所引起的Rh-B特征吸收峰降低的现象能够被2-ImSeCD有效的抑制，说明2-ImSeCD具备清除·OH的能力。Fe2+/Vc诱导线粒体损伤实验表明，2-ImSeCD能够保护线粒体免受损伤体系中的·OH和H2O2的损伤，与体系中加入相同GPX活力的2-SeCD相比，2-ImSeCD的双功能性使其保护线粒体的效果更加明显，表现出其在抗氧化方面优势更为突出。该研究为抗氧化酶的多功能设计提供了重要的实验基础。二、具有GPX活性的含硒生物印迹酶的研究以胰蛋白酶（Trypsin）为骨架，通过化学突变，将Trypsin活性位点丝氨酸（Ser）的侧链羟基（-OH）突变成具有GPX催化活性且较为稳定的次硒酸（-SeO2H），形成Trypsin-SeO2H;再以氧化型谷胱甘肽（GSSG）为印迹分子，使GSH以硒硫键形式连接到Trypsin上，形成Trypsin-Se-SG;之后通过可逆变性使Trypsin-Se-SG的分子伸展，在复性过程中随着伸展蛋白的重新折叠，分子中的-Se-SG与其他结构氨基酸发生相互作用并形成稳定的局部空间构象，最终形成具有底物结合部位（与-SG形成稳定构象的结构氨基酸）和催化基团（-Se）的印迹酶Imprinted Trypsin-Se-SG（ITSeSG）。ITSeSG的GPX活力约为硒化胰蛋白酶（Trypsin-SeH）的7倍，说明通过生物印迹技术构建的底物结合部位对酶活力提高发挥了关键作用，证明了有效识别和结合底物是设计高效模拟酶的重要因素。Trypsin-Se-SG最适pH介于7.0-8.0之间，最适温度为45℃，遵循Michaelis-Menten动力学机制，其催化机制为乒乓机制，与天然GPX相同，该印迹酶的成功制备，能够为以印迹技术制备双功能/多功能抗氧化酶模拟物提供理论和实验依据，为更好理解催化过程中酶与底物的相互作用及相关催化机理奠定基础。

关键词： GPX模拟物 2-ImSeCD 羟自由基抗氧化活性印迹酶

枯草芽孢杆菌（JE21）有机硒转化、中药渣发酵和免疫调节能力研究

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枯草芽孢杆菌（JE21）有机硒转化、中药渣发酵和免疫调节能力研究

作者：张芯吉林大学

学位级别：硕士

枯草芽孢杆菌是一种常用的微生物,具有促进发酵、调节肠道菌群、提高机体免疫能力、提高动物生长性能等能力,是具有广泛应用前景的安全性益生菌。枯草芽孢杆菌不仅可将高毒性低生物利用度的无机硒,转化为低毒性高生物利用度的有机硒,可... 详细信息

枯草芽孢杆菌是一种常用的微生物,具有促进发酵、调节肠道菌群、提高机体免疫能力、提高动物生长性能等能力,是具有广泛应用前景的安全性益生菌。枯草芽孢杆菌不仅可将高毒性低生物利用度的无机硒,转化为低毒性高生物利用度的有机硒,可作为一种安全的生物补硒载体使用。枯草芽孢杆菌还具有强大的发酵分解能力,使其具备中药渣的发酵处理潜力,对中药渣深度利用具有重要意义。本论文利用枯草芽孢杆菌优良的硒转化能力和发酵能力,优化并提高有机硒转化效率的同时对四君子汤中药渣进行发酵处理,既发掘了一种安全有效的补硒益生菌,又获得了能提高四君子汤药渣中皂苷、黄酮等有效成分含量的方法。同时,建立环磷酰胺(CTX)诱导的BALB/c小鼠免疫抑制模型,评价了SeJE21和四君子汤药渣发酵物(SDRF)对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。具体研究工作包括:1、以传统发酵泡菜汁为研究材料,通过筛选与纯化获得一株在高NaSeO浓度条件(50 m M)下生长良好的耐硒JE21菌株;通过筛选和优化JE21菌株的廉价培养基,确定优化廉价培养基组成为碳源比例(葡萄糖:酵母粉)为3:5(0.5 g:0.83 g)、氮源比例(尿素:鱼粉:豆粕)为1:1:10(0.3 g:0.3 g:3 g)、无机盐比例(MnSO:MgSO:NaCl)为1:25:20(0.002 g:0.05 g:0.04 g),当菌体培养物达到相同的生物量时,优化廉价培养基较LB液体培养基成本降低44.83%,为后续JE21大规模培养提供廉价培养基配方;2、通过优化JE21菌株的富硒培养条件,发现廉价优化培养基中的NaSeO添加浓度为1 m M、NaSeO添加时间为开始培养后的第8 h、JE21菌体接种量为4%时,有机硒转化率达到最大值94.61±0.82%,为获得含硒的安全性益生菌富硒JE21(SeJE21)提供技术基础;3、通过单因素法对JE21发酵药食同源组分的四君子汤中药渣条件进行优化,获得总黄酮、总皂苷等生物活性成分含量明显提高的工艺条件。结果表明,当氮源为2%玉米蛋白粉,菌液接种量为6%,料液比为1:20,发酵温度为30℃、发酵时间为60 h时,总皂苷含量由发酵前的13.07 mg/g提高至发酵后的25.31mg/g,提高至1.94倍。总黄酮含量由发酵前3.81 mg/g提高至发酵后的5.99 mg/g,提高至1.57倍,为此类中药渣的微生物处理利用提供了有效途径。4、建立环磷酰胺(CTX)诱导的BALB/c小鼠免疫抑制模型,通过体重变化、脾脏指数、血液和血清生理指标评估SeJE21和四君子汤药渣发酵物(SDRF)的免疫调节作用,采集抗凝全血进行血液指标白细胞(white blood cell,WBC)、淋巴细胞(lymphocyte,LYM)、单核细胞(monocyte,MON)、红细胞(red blood cell,RBC)、血小板(platelet,PLT)计数检测,其余全血离心后取血清进行血清生理指标小鼠γ干扰素(IFN-γ)、小鼠白细胞介素-4(IL-4)、小鼠白细胞介素-6(IL-6)、小鼠白细胞介素-10(IL-10)含量的检测,发现SeJE21冻干粉联合SDRF冻干粉可修复免疫器官损伤,调节血清中细胞因子的含量,有效改善由环磷酰胺(CTX)诱导小鼠模型的免疫抑制,表明SeJE21和SDRF在增强免疫力的应用领域具有一定前景。

关键词：枯草芽孢杆菌硒转化微生物发酵中药渣免疫抑制

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带状疱疹疫苗制备工艺的研究

带状疱疹疫苗制备工艺的研究

作者：李生军吉林大学

学位级别：硕士

带状疱疹(HZ)是由水痘-带状病毒(VZV)引起的好发于春秋季节的急性、炎症性、病毒性皮肤疱疹性病变,疱疹沿感觉神经节分布,多伴有神经痛。带状疱疹不仅具有自限性,而且带状疱疹病毒能够产生后遗神经痛(PHN),从而对患者产生比较严重的影响... 详细信息

带状疱疹(HZ)是由水痘-带状病毒(VZV)引起的好发于春秋季节的急性、炎症性、病毒性皮肤疱疹性病变,疱疹沿感觉神经节分布,多伴有神经痛。带状疱疹不仅具有自限性,而且带状疱疹病毒能够产生后遗神经痛(PHN),从而对患者产生比较严重的影响,最终导致患者的生活质量显著下降。随着中国逐步步入老年社会,带状疱疹发病人群逐年增加,相关报道显示:约50%的带状疱疹发生在60岁以上,而85岁以上的人群中,约一半以上的人可能会发生带状疱疹。通过注射带状疱疹减毒活疫苗,可有效降低带状疱疹的发病概率,还可以减轻发作以后PHN的发生率,缓解带状疱疹的发病症状,减轻老年人发病痛苦提高生活质量。由于带状疱疹存在治愈过程漫长,费用昂贵的问题,而且预防带状疱疹能够减轻患者痛苦,降低家庭经济负担,因此国家推进带状疱疹疫苗具有重大的社会意义。目前,国外有默沙东与GSK两家制药公司生产带状疱疹疫苗,用于预防带状疱疹和带状疱疹后遗神经痛。由于减毒活疫苗形式的带状疱疹疫苗要求单剂量病毒含量处于较高水平才能刺激抗体的产生,所以要求带状疱疹生产工艺必须具有高产的特性,虽然国内已有多家企业获得带状疱疹疫苗临床批件,但是国内市场暂无该疫苗上市。现在国内外企业的带状疱疹疫苗工艺研究多受限于产量低且不能用于大规模制备,因此进行带状疱疹疫苗制备工艺的研究非常必要。带状疱疹疫苗的工艺流程包括:细胞复苏、细胞传代培养、病毒培养、洗涤换液、单次收获物制备、原液制备、半成品制备、成品制备等,工艺的每个工序参数繁多。目前,以细胞工厂为带状疱疹疫苗制备的工艺尚未见报道,本论文通过对细胞培养环节影响因素(细胞传代比例)、病毒培养环节影响因素(培养温度、培养基种类、血清浓度、碳酸氢钠浓度、谷氨酰胺浓度、感染复数(MOI)、病毒接种方式、病毒收获环节影响因素(洗涤条件、离心速度、离心时长、保存时间)等方面进行对比研究。通过对细胞形态、计数细胞、检测病毒滴度、检测卡那霉素残留量及牛血清白蛋白残留量多项指标进行对比分析,最终确定了带状疱疹疫苗的制备工艺。结果显示,不同的细胞传代比例对细胞密度和形态均有影响,转瓶传代至细胞工厂时,细胞传代比例1:2时细胞密度较高,形态较好;采用培养温度在35℃、培养基为日水MEM、血清浓度为2%、碳酸氢钠浓度为5%、谷氨酰胺浓度为1%、感染复数(MOI)在0.01～0.1区间、采用混合接种方式接种病毒,所制备的病毒滴度较高;采用400ml/层洗涤液所制备的单次收获物卡那霉素残留量和牛血清白蛋白残留量较低;采用1500rpm转速离心15min单次收获物滴度高;单次收获物于-60℃以下超低温冰箱保存12个月,滴度稳定。采用优化工艺参数用于带状疱疹疫苗的制备,产量提升3.3倍,且抗生素和牛血清白蛋白含量降低,质量更加安全。

关键词：带状疱疹疫苗细胞工厂感染复数病毒滴度

人源LXRα的酵母重组表达与纯化及活性鉴定

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人源LXRα的酵母重组表达与纯化及活性鉴定

作者：王楠吉林大学

学位级别：硕士

目的:通过对人源LXRα基因进行毕赤酵母系统重组表达,研究LXRα与相关配体的生物结合活性,为今后靶向药物设计奠定基础。方法:以THP-1细胞提取总RNA后,再通过PCR扩增得到LXRα基因,构建pPICZαA-LXRα表达载体,并电转化至毕赤酵母X-33... 详细信息

目的:通过对人源LXRα基因进行毕赤酵母系统重组表达,研究LXRα与相关配体的生物结合活性,为今后靶向药物设计奠定基础。方法:以THP-1细胞提取总RNA后,再通过PCR扩增得到LXRα基因,构建pPICZαA-LXRα表达载体,并电转化至毕赤酵母X-33。经甲醇诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化获得重组蛋白,采用ELISA方法鉴定了重组蛋白的活性与功能。结果:LXRα基因片段成功克隆至表达载体pPICZαA,通过毕赤酵母X-33的甲醇诱导及镍离子亲和层析纯化得到***α蛋白。ELISA实验结果显示***α能够很好的与羟基胆固醇结合。结论:成功构建了pPICZαA-LXRα表达载体,并在毕赤酵母表达系统中实现了分泌表达,表达纯化的LXRα重组蛋白具有良好的结合羟基胆固醇活性,为今后靶向药物设计奠定基础。

关键词：动脉粥样硬化 LXRα 酵母重组表达

基于RPA-LFD的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可视化快速检测方法研究

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基于RPA-LFD的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可视化快速检测方法研究

作者：王雨吉林大学

学位级别：硕士

目前,食源性致病菌引起的食物中毒事件是国内外卫生安全组织关注的重要食品安全问题。常见的食源性致病菌检测方法都有各自的优势,但随着技术的进步这些检测方法都暴露了自己的缺陷。例如:操作繁琐、费时费力、需要专业仪器等,不适合脱... 详细信息

目前,食源性致病菌引起的食物中毒事件是国内外卫生安全组织关注的重要食品安全问题。常见的食源性致病菌检测方法都有各自的优势,但随着技术的进步这些检测方法都暴露了自己的缺陷。例如:操作繁琐、费时费力、需要专业仪器等,不适合脱离实验室进行现场快速检测。因此,开发适用于不同食品基质,可实现现场快速、准确检测食源性致病菌的系统意义重大。本论文建立了一种基于RPA-LFD的快速、可视化检测系统,可以对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌两种重要的食源性致病菌实现高灵敏性、强特异性的快速有效检测。首先,建立RPA检测体系。针对沙门氏菌的靶标基因inv A、金黄色葡萄球菌的靶标基因nuc的相关特征序列,分别设计合成了12对引物进行优化筛选,以琼脂糖凝胶电泳的条带亮度和扩增产物大小对12对引物进行评价。筛选结果显示:引物对F2R1适合沙门氏菌的RPA检测,引物对F1R3适合金黄色葡萄球菌的RPA检测。分别选取一对适宜的扩增引物用于RPA反应体系的扩增反应时间和反应温度优化,确定RPA扩增的最佳反应温度为40℃,最佳的反应时间为20 min。在20℃,反应7.5 min的情况下就可以实现特异性扩增片段,表明该方法可以在接近室温的条件下实现快速检测。使用单核细胞增生李斯特菌、产肠毒性大肠埃希氏菌、埃希氏大肠杆菌（阴性）、巴氏芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌/沙门氏菌六种不同菌株进行方法特异性评价,结果表明所建立的RPA检测方法特异性强。该RPA检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度为20 CFU/m L,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为30CFU/m L。在此基础上,建立RPA-LFD检测系统。根据扩增产物的全长序列设计nfo探针,该探针两端分别标记生物素和阻断基团。下游引物5’端标记FAM荧光信号基团。利用该探针和引物对样品进行检测,若待测样品中含有阳性目标致病菌,扩增出来的DNA双链两端分别携带FAM荧光标记基团和生物素标记基团,在试纸条上流动过程会被固定在测试线（T线）上的抗体捕获形成夹心结构。由于Au NPs的积累,测试线（T线）将显示红色。经过对nfo探针以及下游引物的筛选和优化,确定了可用于特异性检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的探针/引物组合,验证了本研究建立的RPA与试纸条相结合检测方法可以实现沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的可视化检测。最后,利用建立的RPA-LFD方法对实际样品的检测效果进行评价。以猪肉、海鲜、蔬菜、牛奶、鸡蛋作为食品基质,分别向食品基质中加入不同浓度的沙门氏菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液制成加标样品,利用所建立的RPA-LFD检测方法对不同加标样品进行检测。实验结果表明,该方法可以用于特异性地快速检测食物样品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,其检测灵敏度分别为15 CFU/m L,20 CFU/m L。本论文建立的RPA-LFD方法可实现对食品样品中存在的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行可视化快速检测,该方法易于操作、反应迅速、灵敏度高、不需要大型仪器设备和反应结果可视化,适用于对不同类型的食品样品中存在的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌在进行现场快速检测。同时该方法也有望推广用于其他食源性致病微生物的检测,为开发食源性致病微生物的可视化快速检测工具提供理论探索和技术支撑。

关键词： RPA LFD 金黄色葡萄球菌沙门氏菌快速检测食源性致病菌

硒诱导枯草芽孢杆菌表达含硒ZEIN蛋白的研究

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硒诱导枯草芽孢杆菌表达含硒ZEIN蛋白的研究

作者：曲肖男吉林大学

学位级别：硕士

硒(Se)是生物必需的微量元素,具有抗氧化、预防癌症、增强免疫力等重要作用;Met是生物必需的氨基酸,参与蛋白质的合成,影响机体生长发育;两者都无法通过自身代谢合成,必须从体外摄取。在生物体内Se会结合到Met上形成Se-Met,Se-Met具有... 详细信息

硒(Se)是生物必需的微量元素,具有抗氧化、预防癌症、增强免疫力等重要作用;Met是生物必需的氨基酸,参与蛋白质的合成,影响机体生长发育;两者都无法通过自身代谢合成,必须从体外摄取。在生物体内Se会结合到Met上形成Se-Met,Se-Met具有促进肌体生长、增强免疫力、抑制肿瘤生长等功能。针对我国大部分地区缺硒的现状,本研究在筛选确定耐硒枯草芽孢杆菌菌种的基础上,构建并表达高Met含量的玉米醇溶蛋白(ZEIN),获得富硒枯草芽孢杆菌及其表达产物含硒玉米醇溶蛋白(Se-ZEIN)为人体和动物补充Se-Met提供一种新途径。以不同浓度的NaSeO为筛选条件,获得野生型N4、168、WB600、WB800、WB800N五种枯草芽孢杆菌菌种的耐硒生长能力差异,确定在NaSeO浓度高达20mM条件下生长状况良好的WB800N菌种作为后续实验的宿主菌;通过化学合成方法获取玉米醇溶蛋白(ZEIN)基因(NCBI的基因登录号为:541922 dzs10,片段长度为486bp),将其与大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭载体pHT43连接,构建重组质粒pHT43-zein;重组质粒pHT43-zein转化进枯草杆菌WB800N中,获得重组菌WB800N-p HT43-zein;以加入NaSeO的培养液培养重组菌WB800N-pHT43-zein可以获得分子量约为18kDa的Se-ZEIN。分别采用亚甲基蓝和DTNB方法测定培养液上清中NaSeO残余量和菌体的总含硒含量,确定重组菌的硒转化率为74.58%,平均每分子ZEIN蛋白上含有4.3个Se。通过单因素实验确定重组菌的常规培养条件为37℃、180rpm、pH 7.0、接种量6%;响应面法优化培养条件后,硒转化率提升到89.77%,Se-ZEIN每分子蛋白硒结合个数达到5.2个。

关键词：硒硒代甲硫氨酸玉米醇溶蛋白枯草芽孢杆菌表达

催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究

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催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究

作者：赵杨吉林大学

学位级别：硕士

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是众所周知的硒蛋白酶，在生物体内有重要的抗氧化功能，它可以催化还原机体内过多的ROS，使机体免受损伤。由于天然酶来源有制、价格昂贵、稳定性不好、分子量大等缺点限制了它们的实际应用，因此制备高活性... 详细信息

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是众所周知的硒蛋白酶，在生物体内有重要的抗氧化功能，它可以催化还原机体内过多的ROS，使机体免受损伤。由于天然酶来源有制、价格昂贵、稳定性不好、分子量大等缺点限制了它们的实际应用，因此制备高活性的抗氧化酶模拟物具有重要意义。抗体酶技术是产生具有高活力GPx模拟物的有效方法。与全抗相比，通过一个连接肽（Linker）将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）相连接构成的单链抗体Fv段（scFv），其大小为完整抗体分子的1/6，有较强的组织穿透力，因此更具有药用价值。天然GPx的活性中心中含有一个催化三联体结构（即催化模块），它由Sec，Gln和Trp构成，并且这个催化三联体结构是发挥抗氧化活性所必须的。为了模拟出抗体GPx酶，本研究在具有GST活性的单链抗体内引入了与天然GPx相似的催化模块结构。我们以生物信息学理论预测为基础，将scFv-2F3中的52位Ser、29位Phe、72位Val分别突变成Cyc52、Trp29、Gln72，成功构建了与天然GPx催化模块相近的结构，该结构的一级氨基酸序列为Trp29（W）,Cys52（C）,和Gln72（Q）。我们首先用直接突变技术在单链抗体scFv-2F3中引入催化模块Trp29（W）, Cys52（C）和Gln72（Q）得到scFv-2F3-29W52C72Q，然后用大肠杆菌硒代半胱氨酸缺陷表达系统引入GPx的催化氨基酸Sec（U）并表达含硒蛋白，最后用镍亲和层析系统纯化出催化模块组装的含硒单链抗体。为了研究催化模块中不同氨基酸对酶活性影响，我们用直接突变技术获得了几种不同的突变体scFv-2F3-29F52C72V、 scFv-2F3-29W52C72V、 scFv-2F3-29F52C72Q，scFv-2F3-29W52S72Q。通过酶学性质研究表明，引入催化模块后scFv-2F3-29W52U72Q不具有的GST虽然没有活性，但是没有改变52位Ser的突变体对几种特异性底物却显示出GST活性，并与scFv-2F3相比有所提高，它的CDNB是43.9U/μmol，对硝基溴苯是150.54U/μmol，利尿酸是5.02U/μmol。研究显示引入催化三联体的scFv-2F3-29W52C72Q的GPx活性是4235U/μmol，接近天然酶GPx的活性。其他突变体scFv-2F3-29F52U72V、scFv-2F3-29W52U72V、scFv-2F3-29F52U72Q虽显示出GPx的活性，但是都比scFv-2F3-29W52C72Q的低。进一步通过稳态动力学研究表明，scFv-2F3-29W52U72Q的最适温度与最适平pH值都依赖它的GPx活性同样接近天然GPx值，并且GPx催化机制是乒乓机制，因此由催化三联体组成的催化模块对提高GPx活性和稳定性有重要意义。

关键词： GPx GST 单链抗体模拟酶催化三联体