基于RPA-LFD的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可视化快速检测方法研究

作     者：王雨 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕绍武

授予年度：2022年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：RPA LFD 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 快速检测 食源性致病菌 

摘      要：目前,食源性致病菌引起的食物中毒事件是国内外卫生安全组织关注的重要食品安全问题。常见的食源性致病菌检测方法都有各自的优势,但随着技术的进步这些检测方法都暴露了自己的缺陷。例如:操作繁琐、费时费力、需要专业仪器等,不适合脱离实验室进行现场快速检测。因此,开发适用于不同食品基质,可实现现场快速、准确检测食源性致病菌的系统意义重大。本论文建立了一种基于RPA-LFD的快速、可视化检测系统,可以对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌两种重要的食源性致病菌实现高灵敏性、强特异性的快速有效检测。首先,建立RPA检测体系。针对沙门氏菌的靶标基因inv A、金黄色葡萄球菌的靶标基因nuc的相关特征序列,分别设计合成了12对引物进行优化筛选,以琼脂糖凝胶电泳的条带亮度和扩增产物大小对12对引物进行评价。筛选结果显示:引物对F2R1适合沙门氏菌的RPA检测,引物对F1R3适合金黄色葡萄球菌的RPA检测。分别选取一对适宜的扩增引物用于RPA反应体系的扩增反应时间和反应温度优化,确定RPA扩增的最佳反应温度为40℃,最佳的反应时间为20 min。在20℃,反应7.5 min的情况下就可以实现特异性扩增片段,表明该方法可以在接近室温的条件下实现快速检测。使用单核细胞增生李斯特菌、产肠毒性大肠埃希氏菌、埃希氏大肠杆菌（阴性）、巴氏芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌/沙门氏菌六种不同菌株进行方法特异性评价,结果表明所建立的RPA检测方法特异性强。该RPA检测方法对沙门氏菌的检测灵敏度为20 CFU/m L,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为30CFU/m L。在此基础上,建立RPA-LFD检测系统。根据扩增产物的全长序列设计nfo探针,该探针两端分别标记生物素和阻断基团。下游引物5’端标记FAM荧光信号基团。利用该探针和引物对样品进行检测,若待测样品中含有阳性目标致病菌,扩增出来的DNA双链两端分别携带FAM荧光标记基团和生物素标记基团,在试纸条上流动过程会被固定在测试线（T线）上的抗体捕获形成夹心结构。由于Au NPs的积累,测试线（T线）将显示红色。经过对nfo探针以及下游引物的筛选和优化,确定了可用于特异性检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的探针/引物组合,验证了本研究建立的RPA与试纸条相结合检测方法可以实现沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的可视化检测。最后,利用建立的RPA-LFD方法对实际样品的检测效果进行评价。以猪肉、海鲜、蔬菜、牛奶、鸡蛋作为食品基质,分别向食品基质中加入不同浓度的沙门氏菌菌液或金黄色葡萄球菌菌液制成加标样品,利用所建立的RPA-LFD检测方法对不同加标样品进行检测。实验结果表明,该方法可以用于特异性地快速检测食物样品中的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,其检测灵敏度分别为15 CFU/m L,20 CFU/m L。本论文建立的RPA-LFD方法可实现对食品样品中存在的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行可视化快速检测,该方法易于操作、反应迅速、灵敏度高、不需要大型仪器设备和反应结果可视化,适用于对不同类型的食品样品中存在的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌在进行现场快速检测。同时该方法也有望推广用于其他食源性致病微生物的检测,为开发食源性致病微生物的可视化快速检测工具提供理论探索和技术支撑。