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LncRNA H19促进子宫内膜蜕膜化的作用研究

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陆军军医大学学报 2023年第16期45卷 1722-1730页

作者：王婷婷黄靖麟毛艳华张应凤孙聪聪王佳李长江刘拟舟辜鸿黄玺玥陈秋宏吴莎莎谢乐乐张文文重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

目的探究LncRNA H19对子宫内膜蜕膜化的作用。方法采用RT-qPCR检测自然流产和人工流产蜕膜组织中的LncRNA H19表达情况;检测非妊娠子宫内膜和不同孕周蜕膜组织中LncRNA H19的表达;使用MPA和8-Br-cAMP诱导剂诱导子宫内膜间质细胞(transfo... 详细信息

目的探究LncRNA H19对子宫内膜蜕膜化的作用。方法采用RT-qPCR检测自然流产和人工流产蜕膜组织中的LncRNA H19表达情况;检测非妊娠子宫内膜和不同孕周蜕膜组织中LncRNA H19的表达;使用MPA和8-Br-cAMP诱导剂诱导子宫内膜间质细胞(transformed human endometrial stromal cells,THESCs)使其蜕膜化,RT-qPCR检测蜕膜化标志物催乳素(prolactin,PRL)和胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)的表达;检测蜕膜化后LncRNA H19和FOXO1的表达变化;使用慢病毒分别过表达和干扰THESCs中的LncRNA H19,CCK-8检测THESCs的增殖情况。慢病毒转染成功后再诱导蜕膜化,RT-qPCR检测空白对照组、LV-GFP诱导组、LV-H19-RNAi诱导组和LV-H19诱导组的PRL、IGFBP-1和FOXO1的表达。结果自然流产组LncRNA H19表达低于人工流产组(P<0.01);LncRNA H19在孕早期人工流产蜕膜组织第7周达到高峰(P<0.01);THESCs蜕膜化后,PRL、IGFBP-1、LncRNA H19和FOXO1的mRNA表达较对照组增高(P<0.05,P<0.01)。CCK-8结果显示干扰LncRNA H19后THESCs的增殖被抑制(P<0.01),而过表达LncRNA H19后THESCs的增殖被促进(P<0.01)。分别干扰和过表达THESCs的LncRNA H19后再进行蜕膜化诱导,与空白对照组比较,LV-GFP诱导组的PRL(P<0.05)、IGFBP-1(P<0.01)和FOXO1(P<0.01)的mRNA表达升高。与LV-GFP诱导组比较,LV-H19诱导组PRL(P<0.05)和IGFBP-1(P<0.01)的mRNA表达升高,而LV-H19-RNAi诱导组的PRL(P<0.05)、IGFBP-1(P<0.01)和FOXO1(P<0.01)的mRNA表达降低。结论LncRNA H19促进子宫内膜间质细胞增殖和蜕膜化。

关键词： LncRNA H19 FOXO1 蜕膜化自然流产

PKH26标记的人羊膜间充质干细胞在宫腔粘连大鼠中的迁移示踪

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生物工程学报 2018年第10期34卷 1660-1667页

作者：阳媛毛艳华王佳孙聪聪张应凤陈芯培重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

为了观察PKH26标记的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)在宫腔粘连大鼠子宫内膜中的迁移情况,文中提取鉴定及PKH26标记hAMSCs,检测PKH26染色剂对hAMSCs生物学特性的影响;利用机械感染双重法建立大鼠宫腔粘连模型并经尾静脉移植PKH26标记的hAMS... 详细信息

为了观察PKH26标记的人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)在宫腔粘连大鼠子宫内膜中的迁移情况,文中提取鉴定及PKH26标记hAMSCs,检测PKH26染色剂对hAMSCs生物学特性的影响;利用机械感染双重法建立大鼠宫腔粘连模型并经尾静脉移植PKH26标记的hAMSCs,荧光共聚焦显微镜下观察PKH26标记的hAMSCs移植后在大鼠子宫内膜中的分布情况。结果显示,PKH26染色剂对细胞的活性、周期、凋亡等无明显影响,PKH26标记的阳性细胞主要分布在大鼠受损的子宫内膜中。表明PKH26标记技术是一种安全有效的示踪方法,可用于hAMSCs移植在治疗宫腔粘连时的示踪研究。

关键词： PKH26 人羊膜间充质干细胞宫腔粘连示踪

Notch信号通路在人羊膜间充质干细胞移植治疗宫腔粘连中的作用

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第三军医大学学报 2021年第14期43卷 1346-1357页

作者：于结张文文黄佳月勾亚婷毛艳华张应凤孙聪聪吴本媛李长江刘拟舟王婷婷黄吉仁王佳重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

目的探讨Notch信号通路在人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)移植治疗宫腔粘连(intrauterine adhesions, IUA)过程中的作用。方法体外实验:将细胞分为3组,即hAMSCs空白对照组、AdRFP腺病毒转染hAMSCs组、AdR-dnNotch1腺病毒转染hAMSCs组;RT-PCR检测各组中Notch1 mRNA水平,Western blot检测NICD的蛋白表达改变。体内实验:40只Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠分为4组,即假手术组、IUA组、hAMSCs移植治疗组、腺病毒(AdR-dnNotch1)转染hAMSCs后移植治疗组;取各组子宫组织,HE染色检测子宫内膜腺体数目和子宫内膜厚度变化,Masson染色检测纤维化程度变化,免疫组化检测Vimentin、Notch1、NICD、Hes1蛋白表达变化,Western blot检测各组子宫组织中NICD的蛋白表达量,RT-PCR检测各组中Hes1 mRNA水平。通过雌雄合笼评估各组SD大鼠生育力的变化。结果体外实验:Notch1显性负性突变腺病毒(AdR-dnNotch1)可成功抑制Notch信号通路。体内实验:HE、Masson染色结果显示,与IUA组比较,hAMSCs移植组可使腺体数目增多,子宫内膜厚度变薄,纤维化面积比减少(P<0.05),而与IUA组比较,AdR-dnNotch1转染hAMSCs组变化不明显。免疫组化结果显示,与假手术组比较,IUA组中Vimentin表达升高,Notch1、NICD、Hes1表达降低(P<0.05)。与IUA组比较,hAMSCs移植组中Vimentin表达下降,Notch1、NICD、Hes1表达增加(P<0.05),AdR-dnNotch1腺病毒转染组Vimentin、Notch1、NICD、Hes1蛋白表达变化差异无统计学意义;Western blot、RT-PCR结果显示,Notch信号通路在hAMSCs移植治疗组中处于激活状态;雌雄合笼结果显示,与IUA组比较,hAMSCs移植组胚胎数量明显增加(P<0.05),而AdR-dnNotch1转染hAMSCs移植组胚胎数量无明显增加。结论 Notch信号通路参与调控hAMSCs生物学功能,抑制Notch信号通路后,hAMSCs移植治疗宫腔粘连的作用降低。

关键词：宫腔粘连 Notch信号通路人羊膜间充质干细胞生育力

过表达人tRNA甲基转移酶9样蛋白KIAA1456抑制HO8910PM细胞增殖

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第9期32卷 1183-1187页

作者：陈怀梅王佳张应凤高燕洪重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

目的研究人tRNA甲基转移酶9样蛋白KIAA1456的高表达对HO8910PM细胞增殖及细胞周期的影响。方法利用PCR扩增KIAA1456编码区片段,克隆插入载体Ubi-MCS-EGFP-IRES-puromycin中,构建Ubi-KIAA1456-EGFP-puromycin(LV-KIAA1456)慢病毒表达载体;将慢病毒表达载体包装生成慢病毒颗粒并感染HO8910PM细胞,72 h后观察绿色荧光蛋白(GFP)在HO8910PM卵巢癌细胞中的表达分布情况;反转录PCR检测HO8910PM细胞中KIAA1456 mRNA水平,Western blot法检测HO8910PM细胞KIAA1456蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期。结果成功构建重组慢病毒表达载体LV-KIAA1456,慢病毒颗粒感染HO8910PM细胞后,细胞中KIAA1456的mRNA和蛋白均高表达。过表达KIAA1456的HO8910 PM细胞增殖能力明显抑制、G1期细胞明显增加。结论过表达KIAA1456显著抑制HO8910 PM卵巢癌细胞增殖,细胞周期阻滞于G1期。

关键词：卵巢癌 HO8910PM 人tRNA甲基转移酶9样蛋白(KIAA1456) 慢病毒表达载体

PPCNg介导人羊膜间充质干细胞治疗大鼠宫腔粘连的研究

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重庆医科大学学报 2019年第8期44卷 1016-1023页

作者：陈芯培张文文毛艳华阳媛吴本媛李长江勾亚婷于结孙聪聪张应凤王佳重庆医科大学附属大学城医院妇产科

目的:探讨PPCNg聚合物(polyethylene glycol citrate-co-N-isopropylacrylamide gelatin,PPCNg)介导人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)治疗宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)的可行性和有效性。方法:将PKH26标记的hAMSCs在不同浓度PPCNg中培养,48 h后荧光显微镜下观察细胞状态,CCK-8法分析细胞毒性,评价PPCNg的材料毒性。雌性SD级大鼠随机分为假手术组、单纯IUA模型组(模型组)、PPCNg治疗IUA组(PPCNg组)、hAMSCs治疗IUA组(hAMSCs组)及PPCNg联合h AMSCs治疗IUA组(PPCNg+hAMSCs组)。建立IUA模型2周后,假手术组不处理,其余建模的各组分别宫腔内注射PBS、PPCNg、hAMSCs的PBS悬液及hAMSCs的PPCNg悬液。宫腔注射2周后,行子宫组织石蜡切片HE染色和Masson染色检测子宫内膜腺体及纤维化情况,免疫组化检测子宫内膜中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、波形蛋白(vimentin,VIM)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)及E-钙粘附蛋白(E-cadherin,E-Ca)表达情况;冰冻切片荧光显微镜下观察子宫内膜中hAMSCs分布情况。结果:(1)在不同浓度PPCNg中hAMSCs贴壁生长,状态良好;(2)PPCNg无细胞毒性,材料毒性分级为1级(合格);(3)与假手术组相比,模型组腺体数目减少(P=0.000),纤维化面积比增高(P=0.000);与模型组相比,PPCNg组、hAMSCs组及PPCNg+hAMSCs组的腺体数目不同程度增多(P=0.000),纤维化面积比不同程度减少;(4)与模型组相比,PPCNg组、hAMSCs组及PPCNg+hAMSCs组TGF-β1、VEGF、VIM及α-SMA的表达均不同程度降低,其中PPCNg+hAMSCs组明显降低(P=0.000),而CK19及E-Ca表达则不同程度升高,其中PPCNg+hAMSCs组明显升高(P=0.000);(5)PPCNg+hAMSCs组PKH26标记的hAMSCs远远多于hAMSCs组。结论:PPCNg无细胞毒性,能显著提高hAMSCs治疗IUA的有效性。

关键词： PPCNg聚合物人羊膜间充质干细胞宫腔粘连

NF-κB信号通路在人羊膜间充质干细胞治疗宫腔粘连中的作用

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第三军医大学学报 2020年第11期42卷 1101-1108页

作者：勾亚婷张文文李长江于结毛艳华吴本媛张应凤陈芯培黄佳月孙聪聪王佳重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

目的探讨IκB-α/NF-κB信号通路在人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)治疗宫腔粘连(intrauterine adhesion, IUA)中的作用机制。方法体内实验:18只SD大鼠分为Sham组、IUA模型组及hAMSCs组;采用HE及Masson染色分别计数子宫内膜腺体个数及纤维化面积百分比,免疫组化法检测子宫内膜组织中IκB-α(NF-κB抑制蛋白)、核转录因子P65、E-型钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平。体外实验:分别用外源性生长因子[10 ng/mL(TGF-β1+EGF+PDGF-BB),诱导组]及10 nmol/L BAY11-7082联合生长因子[10 ng/mL(TGF-β1+EGF+PDGF-BB),抑制剂组]诱导hAMSCs 5 d,以不加生长因子诱导的hAMSCs作为对照组;RT-PCR检测各组中IκB-α、角蛋白(CK-7、CK-19)的表达水平。结果体内实验:IUA模型组中IκB-α、P65、Vimentin较Sham组表达增加,E-cadherin表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05);hAMSCs组中IκB-α、P65、Vimentin较IUA模型组表达下降,E-cadherin表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:诱导组中IκB-α较对照组表达下降,CK-7表达增加;抑制剂组中CK-7、CK-19较诱导组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hAMSCs移植具有治疗宫腔粘连的作用,其作用机制可能是通过抑制IκB-α/NF-κB通路激活从而促进hAMSCs向子宫内膜上皮细胞转化。

关键词：宫腔粘连人羊膜间充质干细胞干细胞移植 NF-κB

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足月妊娠不同羊水指数对妊娠结局的影响

重庆医科大学学报 2019年第12期44卷 1656-1659页

作者：杨森田立碧胡尚英曹杰重庆医科大学附属大学城医院妇产科

目的:分析足月妊娠孕妇的不同羊水指数对分娩方式的影响。方法:选取2014年至2018年在重庆医科大学附属大学城医院住院分娩的羊水指数(amniotic fluid index,AFI)≤80 mm的足月妊娠孕妇572例作为实验组,以及同时期的81 mm≤AFI≤250 mm... 详细信息

目的:分析足月妊娠孕妇的不同羊水指数对分娩方式的影响。方法:选取2014年至2018年在重庆医科大学附属大学城医院住院分娩的羊水指数(amniotic fluid index,AFI)≤80 mm的足月妊娠孕妇572例作为实验组,以及同时期的81 mm≤AFI≤250 mm的足月妊娠孕妇599例作为对照组。上述两组数据采集样本前均排除易导致剖宫产的产科高危因素,如头盆不称、瘢痕子宫、前置胎盘、胎方位异常、双胎妊娠等。首先按照羊水指数(mm)0~30、31~50、51~65、66~80分组,分别计算各组在住院期间因异常NST或OCT阳性行剖宫产终止妊娠的剖宫产率,并与81~250组的上述数据进行观察分析。结果:0~30、31~50、51~65、66~80及81~250组的剖宫产率分别为79%、55%、47%、44%、44%。上诉各组中的孕妇均顺利分娩,新生儿均未出现窒息、死亡等。经统计软件SPSS 20.0进行行列卡方检验及组间两两比较分析,得出5组之间剖宫产率不全相等(P0.05),31~50组与66~80组差异有统计学意义(P0.05),51~65组与81~250组差异没有统计学意义(P>0.05);66~80组与81~250组差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:羊水指数80 mm及50 mm所区分的羊水偏少及过少对本次研究中的临床工作有明确指导意义,而更细致的羊水量分组对本次研究的临床工作指导意义不明显。

关键词：足月妊娠羊水指数分娩结局

MAPK/ERK信号通路在卵巢上皮性癌组织和细胞中的表达及其临床意义

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中华妇产科杂志 2019年第8期54卷 541-547页

作者：江雪莲高景春姜丽张朋新亢铁金孙倩祁文静张秋萍关宏伟石红大连医科大学附属第一医院妇产科 116011 重庆医科大学附属大学城医院妇产科 401331 大连医科大学附属第一医院病理科 116011

目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织和细胞中的表达及其临床意义。方法(1)收集2004年1月—2013年12月大连医科大学附属第一医院收治的术后病理检查证实为卵巢癌的104例... 详细信息

目的探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织和细胞中的表达及其临床意义。方法(1)收集2004年1月—2013年12月大连医科大学附属第一医院收治的术后病理检查证实为卵巢癌的104例患者的石蜡标本,采用免疫组化SP法检测卵巢癌组织中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达,并分析其与各临床病理特征的关系。(2)蛋白印迹(western blot)法检测MAPK激酶(MEK)抑制剂——司美替尼(AZD6244)作用前后不同卵巢癌细胞(包括SKOV3、OV2008、C13、A2780S、A2780CP、OVCAR4、OVCAR5、OVCAR8和CAOV3细胞共9种)中p-ERK1/2、ERK1/2蛋白的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测AZD6244作用后不同卵巢癌细胞的增殖情况,流式细胞仪检测AZD6244作用后不同卵巢癌细胞的凋亡率及细胞周期比例。结果(1)免疫组化SP法检测显示,p-ERK1/2蛋白的阳性表达率与卵巢癌患者的年龄、病理类型、手术病理分期、术前血清CA125水平均无明显相关性(P>0.05)。进一步分析发现,在不同病理类型的卵巢癌组织中,p-ERK1/2蛋白的阳性表达率,高级别浆液性癌、黏液性癌及子宫内膜样癌均低于低级别浆液性癌(LGSC),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而透明细胞癌与LGSC比较,差异则无统计学意义(P=0.196)。(2)western blot法检测显示,p-ERK1/2、ERK1/2蛋白在9种卵巢癌细胞中均有不同程度的表达;不同浓度(5、10 μmol/L)的AZD6244分别作用于OVCAR5和OVCAR8细胞后,均可抑制p-ERK1/2、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)蛋白的表达,且AZD6244作用后可伴有PARP裂解片段的出现。MTT比色法检测显示,不同浓度(0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)的AZD6244作用后,OVCAR5、OVCAR8和A2780S细胞增殖的抑制率均随着AZD6244浓度的增高而降低,呈显著的浓度依赖性(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,不同浓度(0、5、10 μmol/L)的AZD6244作用后,OVCAR5、OVCAR8和A2780S细胞的凋亡率均随着AZD6244浓度的增高而增高,呈显著的浓度依赖性(P<0.01);OVCAR5和OVCAR8细胞的G0/G1期比例显著增高,S期比例显著降低,呈显著的浓度依赖性(P<0.05)。结论作为MAPK/ERK信号通路的活化形式和功能单位,p-ERK1/2蛋白在卵巢癌组织和细胞中均有不同程度的表达,MEK抑制剂可抑制卵巢癌细胞的增殖、诱发卵巢癌细胞的凋亡。提示,MAPK/ERK信号通路可能在卵巢癌发生、发展中起一定作用,抑制该信号通路有望成为临床治疗卵巢癌的新靶点。

关键词：卵巢肿瘤丝裂原激活蛋白激酶类细胞增殖细胞凋亡磷酸化

雌二醇对人羊膜间充质干细胞增殖、凋亡的影响

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重庆医科大学学报 2019年第3期44卷 282-288页

作者：毛艳华阳媛张应凤孙聪聪陈芯培王佳重庆医科大学附属大学城医院妇产科重庆401331

目的:研究不同浓度雌二醇(estradiol,E2)对人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells,HAMSCs)体外培养中增殖、凋亡的影响。方法:采用改良酶消化法提取HAMSCs,流式细胞学方法和免疫荧光法鉴定提取细胞。HAMSCs培养... 详细信息

目的:研究不同浓度雌二醇(estradiol,E2)对人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells,HAMSCs)体外培养中增殖、凋亡的影响。方法:采用改良酶消化法提取HAMSCs,流式细胞学方法和免疫荧光法鉴定提取细胞。HAMSCs培养方法分为对照组和E2组(分别加入浓度为10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L E2)。CCK-8检测各组HAMSCs增殖情况;q RT-PCR检测干细胞特异基因Oct-4和凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果:CCK-8检测显示各浓度E2组和对照组的HAMSCs增殖活性在1~6 d都随时间的变化而变化(F时间=2 418.132,P时间=0.000);各浓度E2组在1~4 d的增殖率与对照组无明显差异;4 d后,各浓度E2组的增殖率明显高于对照组(F组别=246.601,P组别=0.000),各浓度组间无明显差异。q RT-PCR检测显示10-6 mol/L E2组(1.00±0.10)的Oct-4 m RNA表达水平较对照组(0.58±0.16)和其他E2浓度组(1.31±0.22、0.81±0.04、0.78±0.07)上调(P=0.000,P=0.020,P=0.001,P=0.000);除10-6 mol/L E2组(0.83±0.47,P=0.084)外,其他E2浓度组(0.49±0.25、0.38±0.19、0.32±0.10)抗凋亡基因Bcl-2基因表达量均较对照组(1.06±0.13)下调(P=0.038,P=0.015,P=0.010)。10-5 mol/L E2组(2.20±0.58)的Bax基因较对照组、其他E2浓度组(1.00±0.05、1.52±0.38、1.38±0.17、1.17±0.19)上调(P=0.001,P=0.028,P=0.012,P=0.003)。Western blot检测提示10-5 mol/L E2组(0.514±0.014)的促凋亡蛋白表达Bax较对照组(0.201±0.017)明显上调(P=0.000),而抗凋亡蛋白Bcl-2(0.366±0.024)与对照组(0.215±0.080)之间差异无统计学意义(P=0.055)。而10-6 mol/L E2组(0.378±0.016)的促凋亡蛋白Bax较其他浓度E2组(0.514±0.014、0.547±0.036、0.577±0.028)表达降低(P=0.000)。结论:E2促进HAMSCs的增殖呈时间依赖性,高浓度E2(10-5 mol/L)促进HAMSCs凋亡,较高浓度E2(10-6 mol/L)维持HAMSCs活性并保护其分化潜能。

关键词：间充质干细胞雌二醇增殖凋亡