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基于CRISPR/Cas系统的病原核酸检测技术研究进展

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浙江大学学报(农业与生命科学版) 2023年第5期49卷 618-632页

作者：李红招王浩尹睿乐敏李艳浙江大学海南研究院浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室

作为一种古老的细菌和古菌免疫系统，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas), CRISPR/Cas]系统现已发展为新兴的热门基因编辑工具，极大地推动了其他多个生物学相关领域的发展。其中，通过结合CRISPR/Cas系统与核酸恒温扩增技术建立了一些新型的高效、灵敏、不依赖仪器设备的检测方法，如DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans-reporter, DETECTR）、特异性高灵敏度的酶报告器系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）等，不但提高了CRISPR/Cas系统在不同应用场景下的检测性能，更进一步激发了其在现场检测中的应用潜力。本文基于近年来被广泛应用的3种CRISPR/Cas系统（CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a以及CRISPR/Cas13）的生物核酸检测方法，阐述了CRISPR/Cas系统的生物学意义及一般作用原理，并通过回顾以往开展的CRISPR/Cas系统相关的病原检测研究，比较分析了不同检测系统的特点以及在实际应用过程中可能存在的不足，为针对不同病原在不同应用场景下建立更加高效、合理的CRISPR/Cas系统检测方法提供了有益参考。

关键词： CRISPR/Cas系统 Cas蛋白病原核酸检测方法

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浙江省重要蜱传病原体流行情况调查

中国兽医学报 2023年第6期43卷 1222-1227,1276页

作者：王钊陈学秋杜振东吴飞阳毅敏赵明秀杜爱芳浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室/浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310058

从浙江省杭州、宁波、温州、绍兴、湖州、嘉兴、金华、衢州、台州和丽水等10个城市共采集蜱589只,通过形态学特征和分子生物学方法鉴定其种属,利用PCR方法检测每个蜱样品中是否含有巴贝斯原虫、立克次体、无形体和埃立克体4种病原体的D... 详细信息

从浙江省杭州、宁波、温州、绍兴、湖州、嘉兴、金华、衢州、台州和丽水等10个城市共采集蜱589只,通过形态学特征和分子生物学方法鉴定其种属,利用PCR方法检测每个蜱样品中是否含有巴贝斯原虫、立克次体、无形体和埃立克体4种病原体的DNA,利用双重荧光定量PCR方法检测蜱是否携带非洲猪瘟病毒,运用最大似然估计法计算感染率并进行遗传进化分析。结果显示,本试验采集的蜱主要为血红扇头蜱和长角血蜱;5种蜱传病原体在浙江省优势蜱种中的流行率分别为巴贝斯原虫(5.09%)、立克次体(9.85%)、无形体(7.81%)、埃立克体(1.70%)和非洲猪瘟病毒(0%);在样品中检测到微小巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、黑龙江立克次体、日本立克次体、嗜吞噬细胞无形体和查菲埃立克体,还发现几种病原体未定种。

关键词：蜱传病原体巴贝斯原虫立克次体无形体埃立克体

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益生菌保护动物抵御流感的机制研究进展

浙江大学学报(农业与生命科学版) 2022年

作者：韩美晴王迪彭先启李艳海南浙江大学研究院浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室

流感是一种重要的人畜共患病，高致病性禽流感不仅给我国养殖业带来巨大损失，还严重威胁公共卫生安全。流感病毒能够在猪体内重组并跨越物种障碍进行传播，这给预防流感带来很大挑战。由于流感病毒的变异速度快，流行的病毒株和疫苗株... 详细信息

流感是一种重要的人畜共患病，高致病性禽流感不仅给我国养殖业带来巨大损失，还严重威胁公共卫生安全。流感病毒能够在猪体内重组并跨越物种障碍进行传播，这给预防流感带来很大挑战。由于流感病毒的变异速度快，流行的病毒株和疫苗株之间的差异会降低疫苗的效力，因此增强动物对流感病毒的抵抗力显得尤为重要。益生菌具有调节肠道微生物平衡、促进机体健康的作用，对动物机体抵抗流感病毒是有益的。本文综述了益生菌在动物体内抗流感病毒的作用机制，阐明了益生菌可以通过平衡动物肠道菌群的组成、调节机体黏膜屏障功能、增强或抑制Toll样受体相关分子信号通路等方式直接或间接干扰病毒的侵袭。由于不同菌种发挥的抗病毒作用不同，了解和研究相应机制非常重要。

关键词：流感病毒益生菌免疫肠-肺轴

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益生菌帮助动物抵御流感的机制研究进展

浙江大学学报（农业与生命科学版） 2023年第6期49卷 755-764页

作者：韩美晴王迪彭先启李艳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310058 浙江大学海南研究院海南三亚572025

流感是一种重要的人畜共患病,高致病性禽流感不仅给我国养殖业带来巨大损失,还严重威胁公共卫生安全。流感病毒能够在猪体内重组并跨越物种屏障进行传播,这给预防流感带来巨大挑战。由于流感病毒的变异速度快,流行的病毒株和疫苗株之间... 详细信息

流感是一种重要的人畜共患病,高致病性禽流感不仅给我国养殖业带来巨大损失,还严重威胁公共卫生安全。流感病毒能够在猪体内重组并跨越物种屏障进行传播,这给预防流感带来巨大挑战。由于流感病毒的变异速度快,流行的病毒株和疫苗株之间的差异会降低疫苗的效力,因此增强机体对流感病毒的抵抗力显得尤为重要。益生菌具有调节肠道微生物平衡、促进机体健康的作用,对动物机体抵抗流感病毒是有益的。本文综述了益生菌在动物体内抗流感病毒的作用机制,阐明了益生菌可以通过平衡动物肠道菌群组成、调节机体黏膜屏障功能、增强或抑制Toll样受体相关分子信号通路等方式直接或间接干扰病毒的侵袭,为了解不同菌种发挥抗流感的相应机制及开发更有效的抗流感策略提供了科学依据。

关键词：流感病毒益生菌免疫 “肠-肺轴”

基于体外自连接的猪圆环病毒2型感染性克隆构建方法

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生物工程学报 2024年

作者：孙仁杰杨永乐王雅婷谢荣辉张传亮方维焕李肖梁赵灵燕浙江省动物疫病预防控制中心浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室湘湖实验室

本研究旨在建立一种快速构建猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2， PCV2)感染性克隆的方法。以临床分离的PCV2 LX株为模板，利用DNA无缝克隆技术成功构建了PCV2环状感染性克隆。同时，在基因组体外自连接的构建过程以及拯救病毒... 详细信息

本研究旨在建立一种快速构建猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2， PCV2)感染性克隆的方法。以临床分离的PCV2 LX株为模板，利用DNA无缝克隆技术成功构建了PCV2环状感染性克隆。同时，在基因组体外自连接的构建过程以及拯救病毒的生长特性上，将本方法与常规酶切连接方法进行了比较。本方法无需分析和引入限制性内切酶位点，避免了传统酶切连接的繁琐，能更加高效地进行PCV2基因组的编辑。构建的感染性克隆经脂质体转染细胞，成功拯救获得可以稳定传代的重组病毒。并且重组病毒在PK-15细胞和3D4/31细胞(猪肺泡巨噬细胞系)上具有更强的增殖能力。综上所述，本研究构建了一种基于体外自连接的PCV2反向遗传操作系统，为PCV2基因工程疫苗的研发提供新策略，为其他新发圆环病毒(PCV3和PCV4)感染性克隆的构建提供借鉴。

关键词：猪圆环病毒2型感染性克隆体外自连接病毒拯救

捻转血矛线虫Hc-hrg-2拯救血红素缺陷型酵母生长表型

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中国农业科学 2021年第8期54卷 1795-1804页

作者：周静茹吴飞陈学秋黄艳时恒枝杜爱芳杨怡浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室

【目的】已有研究表明捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母(Saccha... 详细信息

【目的】已有研究表明捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能。【方法】以S. cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1(SGD:S000002640)基因序列5’和3’侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中,经SD/-URA(含250μmol·L5-氨基乙酰丙酸(ALA))培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性。同时以含有H. contortus浙江株Hc-hrg-2序列(GenBank:MK371241)及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n)和Hc-hrg-2(Δgst-c)的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/-URA/-LEU(含250μmol·LALA)培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250μmol·LALA的SD/-URA/-LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。用2%半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600=0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4μL稀释后的菌液点至含有250μmol·LALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28℃培养2—3 d后比较敲除株的生长情况。【结果】成功获得hem1基因敲除株Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA(250μmol·L)或血红素(≥10μmol·L)才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致。Western Blot结果表明2%半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下(≤1μmol·L)促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域(GST-N)和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域(GST-C)的缺失会降低拯救的效果。【结论】捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础。

关键词：捻转血矛线虫血红素 Hc-hrg-2 酿酒酵母 Δhem1敲除株异源表达拯救

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建与鉴定

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中国兽医学报 2022年第8期42卷 1602-1606页

作者：刘嘉韵陈学秋阳毅敏吴飞潘灵韬赵明秀王钊杜爱芳浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室浙江杭州310012

旨在通过芽孢表面展示技术构建柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,为防控鸡球虫感染提供新思路。首先从柔嫩艾美耳球虫和枯草芽孢杆菌基因组中分别扩增EtMIC2基因和芽孢衣壳蛋白编码基因CotB,通过重叠PCR技术将两者融合后克隆... 详细信息

旨在通过芽孢表面展示技术构建柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,为防控鸡球虫感染提供新思路。首先从柔嫩艾美耳球虫和枯草芽孢杆菌基因组中分别扩增EtMIC2基因和芽孢衣壳蛋白编码基因CotB,通过重叠PCR技术将两者融合后克隆至pDG364中,构建整合型重组质粒pDG364-CotB-EtMIC2,并通过电转化将融合基因CotB-EtMIC2整合于枯草芽孢杆菌amyE基因位点,最后利用PCR、Western blot和免疫荧光等技术进行鉴定。结果显示,成功克隆目的基因EtMIC2,与锚定元件CotB融合成功,且定点整合于枯草芽孢杆菌基因组,融合蛋白正确表达并可在芽孢表面检测到特异性荧光信号。本研究成功构建能够表面展示EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,可用于后续评估其抗球虫免疫保护效果。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 EtMIC2 枯草芽孢杆菌芽孢表面展示

绵羊成纤维细胞OAR-L1高效转染方法的探索

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2022年第1期48卷 96-105页

作者：吴飞吴杰陈学秋周静茹张惠黄艳时恒枝杨怡马光旭杜爱芳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

为了在绵羊肺成纤维细胞OAR-L1中高效表达外源蛋白,探索适合该细胞的转染方法,本研究比较了聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、脂质体2000转染试剂(Lipofectamine^(TM) 2000 transfection reagent,Lipo 2000)、成纤维细胞转染试剂盒(Cytofect^(TM) fibroblast transfection kit,CF2)以及慢病毒介导的细胞转染方法在OAR-L1细胞中表达外源蛋白的效果。结果显示:以pLentiCMV-EGFP-Puro或pLentiCMV-mCherry-Puro荧光质粒转染OAR-L1细胞时,细胞密度和转染试剂用量均可影响PEI、Lipo 2000和CF2介导的细胞转染效率,且三者最佳转染效率均不超过30%,而慢病毒介导的细胞侵染不受细胞密度和病毒液用量的限制,获得的荧光细胞数目也显著高于前三者。包装好的病毒液可以在4或-80℃条件下至少保存15 d而侵染效果不受影响。在OAR-L1细胞中共表达2种外源蛋白时,包装获得的2种慢病毒液等比例混合后再侵染的方式能获得更高的共转率。综上所述,慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式,本研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

关键词：成纤维细胞OAR-L1 转染方法慢病毒绵羊

弓形虫泛素特异性蛋白酶TgUSP10的定位及其功能

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中国兽医学报 2022年第12期42卷 2444-2451页

作者：陈璐璐孙洪超阳毅敏盛楷茵姚晨倩陈学秋杨怡杜爱芳浙江大学动物科学学院、浙江省动物预防医学重点实验室/浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310012 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫泛素特异性蛋白酶TgUSP10的内源性标记虫株,经单克隆后通过PCR和Western blot对内源性标记虫株进行鉴定,并通过间接免疫荧光试验分析了TgUSP10蛋白的亚细胞定位与表达水平;同时,构建TgUSP10敲除虫株,经单... 详细信息

利用CRISPR/Cas9技术构建弓形虫泛素特异性蛋白酶TgUSP10的内源性标记虫株,经单克隆后通过PCR和Western blot对内源性标记虫株进行鉴定,并通过间接免疫荧光试验分析了TgUSP10蛋白的亚细胞定位与表达水平;同时,构建TgUSP10敲除虫株,经单克隆后进行PCR鉴定,并通过噬斑、黏附/入侵、复制和逸出试验评估TgUSP10缺失对弓形虫体外增殖的影响。IFA结果显示,TgUSP10定位于细胞质,并在G1期、S期和分裂后期表达量较高;成功构建了TgUSP10敲除虫株,与RH△ku80虫株相比,TgUSP10敲除虫株形成噬斑的能力显著减弱;进一步分析体外增殖的具体过程后发现,TgUSP10敲除虫株的复制能力显著减弱,而黏附/入侵和逸出能力没有显著变化。结果表明,成功构建了TgUSP10的内源性标记虫株,TgUSP10定位于虫体细胞质,并对弓形虫体外增殖具有重要作用,为后续进一步阐明其功能和作用机制奠定基础。

关键词：弓形虫去泛素化酶 TgUSP10 CRISPR/Cas9