捻转血矛线虫Hc-hrg-2拯救血红素缺陷型酵母生长表型

作     者：周静茹 吴飞 陈学秋 黄艳 时恒枝 杜爱芳 杨怡 ZHOU JingRu;WU Fei;CHEN XueQiu;HUANG Yan;SHI HengZhi;DU AiFang;YANG Yi

作者机构：浙江大学动物科学学院/浙江省动物预防医学重点实验室 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2021年第54卷第8期

页      面：1795-1804页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家自然科学基金(31602041) 国家重点研发计划(2017YFD0501200) 浙江省基础公益研究计划(LGN20C180005) 

主　　题：捻转血矛线虫 血红素 Hc-hrg-2 酿酒酵母 Δhem1敲除株 异源表达 拯救 

摘      要：【目的】已有研究表明捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能。【方法】以S. cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1(SGD:S000002640)基因序列5’和3’侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中,经SD/-URA(含250μmol·L5-氨基乙酰丙酸(ALA))培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性。同时以含有H. contortus浙江株Hc-hrg-2序列(GenBank:MK371241)及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n)和Hc-hrg-2(Δgst-c)的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/-URA/-LEU(含250μmol·LALA)培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250μmol·LALA的SD/-URA/-LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。用2%半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600=0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4μL稀释后的菌液点至含有250μmol·LALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28℃培养2—3 d后比较敲除株的生长情况。【结果】成功获得hem1基因敲除株Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA(250μmol·L)或血红素(≥10μmol·L)才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致。Western Blot结果表明2%半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下(≤1μmol·L)促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域(GST-N)和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域(GST-C)的缺失会降低拯救的效果。【结论】捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础。