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猪鼻支原体临床分离株体外抗生素敏感性研究

中国兽医科学 2024年第4期54卷 553-559页

作者：邵佳韦艳娜王佳李俊黄媛媛华利忠甘源刘蓓蓓冯志新邵国青王先炜熊祺琰南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏... 详细信息

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏感,其MIC_(50)为0.030μg/mL,MIC_(90)为0.125μg/mL;对多西环素与环丙沙星也较为敏感,MIC_(50)和MIC_(90)值均为0.50和1.00μg/mL;对泰乐菌素和泰万菌素的MIC呈现双峰分布;对替米考星和林可霉素的MIC_(90)值均达到≥128μg/mL,分别有29%和32%的菌株MIC≥128μg/mL,出现了明显的耐药趋势。本研究结果丰富了我国Mhr临床菌株的药物敏感性数据,为临床用药提供了数据支撑及合理指导。

关键词：猪鼻支原体临床分离株药物敏感性

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N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

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江苏农业学报 2024年第3期40卷 508-513页

作者：刘维龙胡波范志宇魏后军仇汝龙宋艳华陈萌萌葛雷熊富强王芳江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 西藏农牧学院西藏林芝860000 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重... 详细信息

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：兔出血症病毒 VP60蛋白 B细胞表位免疫原性

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猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 271-281页

作者：谢青云邢蕙萱于岩飞袁厅熊祺琰熊富强冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 西藏农牧学院动物科学学院林芝850400 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300 南京农学大学动物医学院南京210095

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗... 详细信息

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体解旋酶RuvA DNA结合多克隆抗体

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江苏省羊肠道病毒感染的流行病学调查

中国兽医学报 2024年第6期 1140-1147页

作者：蔡旭航李文良李基棕李思远毛立许信刚李彬西北农林科技大学动物医学院江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室

羊肠道病毒(caprine enterovirus, CEV)是新发现的感染山羊的重要腹泻病病原之一。为了解CEV在江苏省部分地区羊群中的流行情况，从江苏省8县市采集了410份羊粪便样品，包括腹泻样品212份、非腹泻样品198份。通过RT-PCR方法检出CEV阳性... 详细信息

羊肠道病毒(caprine enterovirus, CEV)是新发现的感染山羊的重要腹泻病病原之一。为了解CEV在江苏省部分地区羊群中的流行情况，从江苏省8县市采集了410份羊粪便样品，包括腹泻样品212份、非腹泻样品198份。通过RT-PCR方法检出CEV阳性127份，各地阳性率差异较大，分布在12.50%～62.50%,总阳性率则高达30.98%,分析腹泻和非腹泻样品阳性率，发现CEV是导致山羊腹泻的重要病原之一。对获得的CEV毒株VP1序列同源性和遗传进化分析表明，江苏省流行的CEV亚型包括EV-G5、G7、G21、G22和G23,其中G21～G23均为新的亚型。同源性分析表明，检测毒株的5′-UTR、VP1和2AB序列与CEV-JL14等国内参考毒株的同源性分别为71.8%～95.8%、56.9%～95.0%和77.9%～98.4%,其中HaiMen-SJH株的5′-UTR和2AB序列与其他参考序列差异较大，在遗传进化关系中形成独立分支。根据流调结果，CEV感染在江苏省各地区广泛存在，是造成山羊腹泻的重要病因之一，不同地区流行毒株及流行情况均存在差异。本研究丰富了我国CEV的流行病学资料，为针对性地防控羊新发肠道病毒感染提供了理论依据。

关键词：羊肠道病毒腹泻流行病学调查进化分析

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绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

畜牧兽医学报 2024年第4期55卷 1728-1737页

作者：杜改梅王月茅慧华雷卫强储岳峰刘茂军金陵科技学院动物科学与食品工程学院南京210038 中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院/动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μ... 详细信息

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

关键词：绵羊肺炎支原体小鼠感染模型

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猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 1-11页

作者：陈蓉郝飞谢星赵琳韦艳娜张磊王丽熊琪琰邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和... 详细信息

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

关键词：猪肺炎支原体亮氨酸氨肽酶结构活性位点

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N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

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江苏农业科学 2024年第12期52卷 183-187页

作者：董文宇刘维龙胡波范志宇魏后军仇汝龙宋艳华陈萌萌葛雷熊富强王芳西藏农牧学院西藏林芝860000 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 南京农业大学江苏南京210095 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入... 详细信息

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

关键词：兔出血症病毒 VP60蛋白 HBGAs 病毒样颗粒免疫原性

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牛轮状病毒多克隆抗体制备及特性分析

畜牧与兽医 2024年第7期56卷 72-77页

作者：孙心如孙敏周洪婷李素芬张雪寒周金柱贡嘎索朗斯珠李彬西藏农牧学院动物科学学院西藏林芝860000 江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014

旨在优化G6P[1]型牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)在MARC-145细胞中的培养条件,制备其兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。对G6P[1]型BRV毒株NCDV进行不同病毒接种量及收毒时间优化,确定病毒在MARC-145细胞中的最佳... 详细信息

旨在优化G6P[1]型牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)在MARC-145细胞中的培养条件,制备其兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。对G6P[1]型BRV毒株NCDV进行不同病毒接种量及收毒时间优化,确定病毒在MARC-145细胞中的最佳培养条件;以1×10^(7) TCID_(50) NCDV活毒作为免疫原免疫成年兔,制备兔源多克隆抗体;通过间接ELISA检测多抗效价,并通过间接免疫荧光试验(IFA)及中和试验鉴定其特异性。结果:NCDV毒株以感染比0.1、感染时间24 h为最佳培养条件,病毒滴度可至4.9×10^(6) TCID_(50)/mL;间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶51 200,表明NCDV具有良好的免疫原性;IFA及中和试验结果表明,NCDV多克隆抗体与G6P[1]型、G9P[1]型和G10P[11]型BRV毒株均能发生特异性反应,存在良好的交叉中和效应,表明制备的多抗具有良好的反应性。综上,本试验成功优化了NCDV毒株在MARC-145细胞中的增殖条件,并制备了高效价的兔源多克隆抗体,为后续BRV感染的血清学诊断及疫苗研发奠定了理论基础。

关键词：牛轮状病毒 NCDV毒株 MARC-145细胞多克隆抗体

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犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

中国兽药杂志 2024年第5期58卷 10-16页

作者：王卓徐司雨夏兴霞李志敏毕振威钱晶莫菲诸玉梅王永山孙树民谭业平内蒙古民族大学内蒙古通辽028000 江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9... 详细信息

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。

关键词：犬 PD-1 单克隆抗体肿瘤