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绵羊肺炎支原体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2024年

作者：王晓楠张纹纹陈思宇单依依陈益李文良程子龙杨蕾蕾王金泉刘茂军新疆农业大学动物医学学院江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)的抗原快速定量检测方法，本研究通过单抗筛选和条件优化，建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法，建立的ELISA方法的最优条件为：单抗1A11 浓度为105 μg/mL，37 ℃孵育1 h后4 ... 详细信息

为建立绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)的抗原快速定量检测方法，本研究通过单抗筛选和条件优化，建立了一种检测MO抗原夹心ELISA检测方法，建立的ELISA方法的最优条件为：单抗1A11 浓度为105 μg/mL，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜包被；用10 g/L BSA 37 ℃封闭1 h；与超声处理的样品作用1.5 h；检测抗体浓度为3.81 μg/mL，37 ℃作用2 h；酶标抗体1∶4 000稀释，37 ℃反应1.5 h；加入底物37 ℃避光反应10 min。建立的夹心ELISA方法批间和批内变异系数均低于10%，特异性、重复性、敏感性良好，本方法检测的抗原含量与MO的CCU呈正相关。本方法的建立为绵羊肺炎支原体的定量检测提供了新技术，可用于实验室MO培养物CCU含量的替代检测和MO疫苗生产过程中抗原的检测。

关键词：绵羊肺炎支原体夹心ELISA 建立

半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

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江苏农业学报 2024年第4期40卷 682-689页

作者：刘蓓蓓韦艳娜陈蓉谢星倪博郝飞张珍珍白昀袁厅冯志新江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规... 详细信息

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

关键词：非洲猪瘟病毒 pA104蛋白单克隆抗体半固体培养法

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猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1249-1256页

作者：黄媛媛王佳陈嘉瑜甘源袁厅冯志新邵国青王先炜熊祺琰南京农业大学动物医学院南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学... 详细信息

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

关键词：腹膜间皮细胞原代培养猪猪鼻支原体

基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立

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江苏农业学报 2024年第3期40卷 514-521页

作者：杨利张浩明乔绪稳陈瑾郑其升程海卫江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心江苏泰州225300

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMD... 详细信息

本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。

关键词：口蹄疫病毒双特异性纳米抗体血凝检测法

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包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的制备及佐剂活性

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江苏农业学报 2024年第1期40卷 141-148页

作者：秦竹陈瑾侯立婷乔绪稳李兰杨利杜露平于晓明张元鹏郑其升江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品国泰技术创新中心江苏泰州225300

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得... 详细信息

重组CTA1-DD蛋白具有与完整CT分子相当的全身性和黏膜佐剂功能,但在复杂的生理环境中易被酶或酸降解。本研究以同样具有佐剂活性的O-羧甲基壳聚糖(OCS)和硫酸葡聚糖(DS)为载体,通过离子交联形成纳米颗粒,将CTA1-DD蛋白嵌入其中,使其得到稳定保护。包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒的粒径为50~150 nm,Zeta电位约-50 mV,质量浓度1.0 mg/ml的CTA1-DD蛋白投入制备的包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒载药率25.33%,包封率86.56%。体外模拟释放试验结果显示CTA1-DD蛋白可在7 d内缓慢释放。将CTA1-DD蛋白与PRV灭活抗原混合后,接种至小鼠鼻腔,结果表明,包裹有CTA1-DD蛋白的OCS-DS纳米颗粒能够同时诱导更高的血清IgG抗体和黏膜IgA抗体表达,证明了其作为黏膜佐剂的高效性。

关键词： CTA1-DD蛋白 O-羧甲基壳聚糖硫酸葡聚糖纳米颗粒佐剂活性

新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

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畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 660-669页

作者：毕振威王文杰刘雅坤彭大新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室扬州225009 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及... 详细信息

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

关键词： A型流感病毒(IAV) 犬酸性核磷蛋白32A(caANP32A) RNA聚合酶活性哺乳动物适应性

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 300-310页

作者：白昀谢青云欧阳伟甘源袁厅赵东明步志高邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 详细信息

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

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猪鼻支原体临床分离株体外抗生素敏感性研究

中国兽医科学 2024年第4期54卷 553-559页

作者：邵佳韦艳娜王佳李俊黄媛媛华利忠甘源刘蓓蓓冯志新邵国青王先炜熊祺琰南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏... 详细信息

为探究猪鼻支原体(Mhr)临床分离株对常见抗生素的敏感性,利用微量肉汤稀释法检测12种临床常见支原体病治疗用抗生素对本实验室2010-2021年间分离得到的31株Mhr临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)。结果显示:Mhr临床分离菌株对泰妙菌素最为敏感,其MIC_(50)为0.030μg/mL,MIC_(90)为0.125μg/mL;对多西环素与环丙沙星也较为敏感,MIC_(50)和MIC_(90)值均为0.50和1.00μg/mL;对泰乐菌素和泰万菌素的MIC呈现双峰分布;对替米考星和林可霉素的MIC_(90)值均达到≥128μg/mL,分别有29%和32%的菌株MIC≥128μg/mL,出现了明显的耐药趋势。本研究结果丰富了我国Mhr临床菌株的药物敏感性数据,为临床用药提供了数据支撑及合理指导。

关键词：猪鼻支原体临床分离株药物敏感性

一株GI-19基因型禽传染性支气管炎病毒基因序列分析及致病性研究

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中国家禽 2024年

作者：武奇徐梦成魏邓乐张雪花李丁梅梅江苏省农业科学院动物免疫工程研究所扬州大学兽医学院教育部禽类预防医学重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心

为了解传染性支气管炎病毒（IBV）的遗传变异及致病性，试验对江苏某鸡场发病鸡进行病原分离和鉴定，并对分离株S1基因进行同源性、遗传进化树、糖基化位点、S蛋白裂解位点和致病性分析。结果显示：从发病鸡肾脏组织中分离并鉴定到1株IB... 详细信息

为了解传染性支气管炎病毒（IBV）的遗传变异及致病性，试验对江苏某鸡场发病鸡进行病原分离和鉴定，并对分离株S1基因进行同源性、遗传进化树、糖基化位点、S蛋白裂解位点和致病性分析。结果显示：从发病鸡肾脏组织中分离并鉴定到1株IBV，该分离株经SPF鸡胚盲传5代后，可引起典型的侏儒胚特征病变，其S1基因大小为1 620 bp，分离株被命名为CK/CH/WJ215;CK/CH/WJ215与GⅠ-19基因型毒株S1核苷酸序列相似性为94.3%，与流行优势基因型GⅠ-19属于同一分支；RDP4重组分析显示该分离株S1蛋白不存在重组事件；进一步糖基化位点分析表明，与常用疫苗株相比，CK/CH/WJ215 S1蛋白在第51、77、103、138、163、178、247、276、283、530位点出现变异，值得注意的是，与H120疫苗株和QXL87疫苗株相比，CK/CH/WJ215 S1蛋白分别在138和530位出现了新的糖基化位点；7日龄SPF鸡致病性试验显示，该分离株可导致SPF鸡100%(15/15)发病，66.7%(10/15)死亡，并且导致严重的肾脏病变；感染鸡从第2天开始持续排毒，直到第21天气管和泄殖腔排毒率仍为80%(4/5)和100%(5/5)。研究表明，从江苏某鸡场发病鸡群种分离的GⅠ-19基因型IBV对SPF雏鸡具有很强的致病性，结果为该地区传染性支气管炎流行病学及防控提供参考。

关键词：传染性支气管炎病毒 GⅠ-19基因型 S1基因致病性