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大肠杆菌肌苷酸节点代谢优化高效合成肌苷

食品与发酵工业 2024年第4期50卷 44-50页

作者：刘铁重高志强侯德欣谢希贤吴鹤云天津科技大学生物工程学院天津300457 工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学) 天津300457

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达... 详细信息

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达,以强化腺苷合成支路,使菌株5 L发酵罐上的肌苷产量达到了29.5 g/L,且无需额外添加腺嘌呤。接着通过替换guaB基因的原有启动子以弱化鸟苷合成支路,并过表达guaC基因促使鸟苷酸回流至肌苷酸,使菌株副产物含量显著降低且肌苷产量提升至35.1 g/L;最后对不同5′-核苷酸酶进行了筛选和强化,发现引入来自酿酒酵母的特异性5′-核苷酸酶基因(introduction of specific 5′-nucleotidase gene,ISN1)可有效促进肌苷生产。最终所得菌株INO7-6在5 L发酵罐上发酵,肌苷产量为41.2 g/L,转化率为0.17 g/g葡萄糖,生产强度为0.86 g/(L·h),为目前报道的基因工程菌株的最高产量。

关键词：肌苷肌苷酸大肠杆菌代谢工程发酵

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重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

生物工程学报 2024年第3期40卷 799-811页

作者：王倩倩刘亚琦屈琰刘欢高歌徐庆阳陈宁范晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,... 详细信息

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

关键词：假尿苷大肠杆菌全细胞催化假尿苷-5-磷酸糖苷酶核糖激酶核糖核苷水解酶

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

基于异源表达和甲基化修饰制备抗自切重组胰蛋白酶

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微生物学报 2024年

作者：于文娟许伟洲孙娜娜孙颖李玉强杨霁菡路福平王洪彬天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【... 详细信息

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【方法】通过基因重组技术实现猪胰蛋白酶酶原在毕赤酵母中的异源表达；通过单因素试验对酶原激活的温度、pH和时间进行考察和优化；通过探索甲基化修饰方法提高重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结果】成功构建了胰蛋白酶酶原的毕赤酵母工程菌株，优化了酶原的肠激酶激活条件，考察了胰蛋白酶浓度、甲基化试剂添加量和反应时间对甲基化效果的影响，在胰蛋白酶浓度10 mg/mL，甲基化试剂添加量30 μL，反应时间3 h条件下，所获甲基化酶在酶活损失仅22%情况下，自切6 h酶活保留率提高达到了79%，相比对照提高了约3.4倍，大幅提高了重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结论】本研究基于异源表达和甲基化修饰成功制备了新型抗自切重组胰蛋白酶，该成果有助于提高我国胰蛋白酶的生产和应用水平。

关键词：胰蛋白酶甲基化抗自切

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黑曲霉碱性蛋白酶CpyC的生化特征解析

食品与发酵工业 2024年

作者：程磊王正祥天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院

本文对一种黑曲霉来源的蛋白酶CpyC进行了生化特征解析。该酶在结构与组成上具有丝氨酸蛋白水解酶SB家族特征性催化活性中心，由Asp188、His226和Ser381氨基酸残基组成，序列特征接近丝氨酸蛋白水解酶SB家族S08类，但与现有家族成员分... 详细信息

本文对一种黑曲霉来源的蛋白酶CpyC进行了生化特征解析。该酶在结构与组成上具有丝氨酸蛋白水解酶SB家族特征性催化活性中心，由Asp188、His226和Ser381氨基酸残基组成，序列特征接近丝氨酸蛋白水解酶SB家族S08类，但与现有家族成员分类特征并不完全相同。重组CpyC的最适作用温度和pH分别为50 ℃和8.0，Ca2+和Co2+对其分别具有最强的激活作用和抑制作用，丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂苯甲基磺酰氟对其具有较强抑制作用，可见，黑曲霉蛋白酶CpyC是一种碱性丝氨酸蛋白酶。CpyC水解大豆分离蛋白结果显示，该酶具有水解蛋白质为多肽和寡肽的活性特征，在蛋白质生物加工中可能具有潜在应用价值。

关键词：碱性丝氨酸蛋白酶黑曲霉克隆与表达生化特征蛋白质水解

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代谢工程改造大肠杆菌生产胸苷

生物工程学报 2024年

作者：姚卓越李然蒋帅吴鹤云马倩谢希贤天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷... 详细信息

胸苷作为抗艾滋病药物(叠氮胸苷和司他夫定)的关键前体物，在医药行业具有很大的应用潜力。本研究以野生型大肠杆菌(Escherichia coli) MG1655为底盘微生物，采用系统代谢工程策略重构大肠杆菌中胸苷合成途径，构建了一株高效合成胸苷的工程菌株。首先，依次敲除deoA、tdk、udp、rihA、rihB、rihC基因，以阻断胸苷的分解途径和补救途径；随后，引入来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) F126的嘧啶核苷操纵子基因，以增强前体物尿苷酸合成途径代谢通量；最后，依次优化胸苷合成途径中尿苷酸激酶、核糖核苷二磷酸还原酶、胸苷酸合酶和5’-核苷酸酶的表达，以强化尿苷至胸苷合成途径代谢通量。所构建的THY6-2工程菌株在5 L分批补料发酵实验中胸苷产量为11.1 g/L、转化率为0.04 g/g 葡萄糖、生产强度为0.23 g/(L?h)。本研究构建了以葡萄糖为唯一碳源且不携带质粒的高效合成胸苷工程菌株，为其他嘧啶核苷类产品的研发提供借鉴意义。

关键词：胸苷大肠杆菌代谢工程从头合成途径

通过失活Sec途径阻遏蛋白和胞外蛋白酶提高地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力

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中国生物工程杂志 2024年第2期44卷 39-47页

作者：郝漫惠威邵岚莹史超硕路福平张会图天津科技大学生物工程学院应用微生物与酶工程实验室天津300457

为了探究Sec分泌途径对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶产量的影响,对地衣芽孢杆菌TCCC11470(BLΔuppΔepsΔpgs)中的分子伴侣阻遏蛋白基因hrcA和基因组中3个Sec途径分泌的胞外蛋白酶基因epr、bpr和vpr进行叠加敲除。... 详细信息

为了探究Sec分泌途径对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶产量的影响,对地衣芽孢杆菌TCCC11470(BLΔuppΔepsΔpgs)中的分子伴侣阻遏蛋白基因hrcA和基因组中3个Sec途径分泌的胞外蛋白酶基因epr、bpr和vpr进行叠加敲除。通过对比分析基因缺失前后的碱性蛋白酶酶活力发现,敲除菌株TCCC11470ΔhrcA和TCCC11470ΔhrcAΔeprΔbprΔvpr在42 h的碱性蛋白酶酶活力分别达到18521.2 U/mL和20048.5 U/mL,分别高出对照菌株BLΔuppΔepsΔpgs(14478.6 U/mL)27.9%和38.5%。这一结果指出,通过改进Sec分泌通路可以显著提升碱性蛋白酶的催化效能,为构建优化的工业酶生产宿主提供了新思路和研究方向。

关键词：地衣芽孢杆菌 Sec分泌途径碱性蛋白酶 HrcA 胞外蛋白酶

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中国传统白酒风味酯合成研究进展

食品科技 2024年第3期49卷 8-16页

作者：袁宇轩张紫瑗李姝均林良才天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457

传统发酵食品是我国食品工业中的重要分支,而白酒则是传统发酵食品的重要组成部分。开放式的固态生态发酵方式赋予了白酒独特的风味属性,其中酯类化合物是白酒中最重要的一类香味成分,其组成和含量与酒体感官、品质密切相关。研究表明... 详细信息

传统发酵食品是我国食品工业中的重要分支,而白酒则是传统发酵食品的重要组成部分。开放式的固态生态发酵方式赋予了白酒独特的风味属性,其中酯类化合物是白酒中最重要的一类香味成分,其组成和含量与酒体感官、品质密切相关。研究表明微生物合成代谢途径和酶促反应是白酒酿造过程中酯类物质积累的主要生物途径。文章系统总结了白酒酿造过程中酯类化合物的种类,在此基础上,概述了微生物和酯合成酶在风味酯合成方面的研究现状,并对未来风味酯合成的研究方向进行了展望。

关键词：白酒风味酯微生物酯类合成代谢脂肪酶角质酶

核酸切除修复途径相关基因对酿酒酵母耐受性的影响

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 109-117页

作者：刘玲王玥琦刘治国王金晓林良才张翠英天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核... 详细信息

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核酸切除修复途径,通过基因工程手段,探究酿酒酵母内源核酸切除修复基因(RAD 16、RAD7、RAD23和RAD4)和外源基因(UVRA)对酿酒酵母耐受性的影响。结果表明,过表达酿酒酵母自身核酸切除修复基因RAD16、RAD7、RAD23及RAD4提高了酿酒酵母高渗耐受性。过表达UVRA基因可以提高菌株高渗耐受性,这意味着该元件在真核和原核细胞中存在功能上的保守性。这些结果有助于提高酿酒酵母对环境胁迫尤其是高渗透压环境的耐受性,并为研究酵母耐受性机制提供了新的思路。

关键词：酿酒酵母核酸切除修复基因菌株选育高渗耐受性基因编辑