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基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

核酸切除修复途径相关基因对酿酒酵母耐受性的影响

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 109-117页

作者：刘玲王玥琦刘治国王金晓林良才张翠英天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核... 详细信息

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核酸切除修复途径,通过基因工程手段,探究酿酒酵母内源核酸切除修复基因(RAD 16、RAD7、RAD23和RAD4)和外源基因(UVRA)对酿酒酵母耐受性的影响。结果表明,过表达酿酒酵母自身核酸切除修复基因RAD16、RAD7、RAD23及RAD4提高了酿酒酵母高渗耐受性。过表达UVRA基因可以提高菌株高渗耐受性,这意味着该元件在真核和原核细胞中存在功能上的保守性。这些结果有助于提高酿酒酵母对环境胁迫尤其是高渗透压环境的耐受性,并为研究酵母耐受性机制提供了新的思路。

关键词：酿酒酵母核酸切除修复基因菌株选育高渗耐受性基因编辑

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重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

生物工程学报 2024年第3期40卷 799-811页

作者：王倩倩刘亚琦屈琰刘欢高歌徐庆阳陈宁范晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,... 详细信息

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

关键词：假尿苷大肠杆菌全细胞催化假尿苷-5-磷酸糖苷酶核糖激酶核糖核苷水解酶

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中国传统白酒风味酯合成研究进展

食品科技 2024年第3期49卷 8-16页

作者：袁宇轩张紫瑗李姝均林良才天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457

传统发酵食品是我国食品工业中的重要分支,而白酒则是传统发酵食品的重要组成部分。开放式的固态生态发酵方式赋予了白酒独特的风味属性,其中酯类化合物是白酒中最重要的一类香味成分,其组成和含量与酒体感官、品质密切相关。研究表明... 详细信息

传统发酵食品是我国食品工业中的重要分支,而白酒则是传统发酵食品的重要组成部分。开放式的固态生态发酵方式赋予了白酒独特的风味属性,其中酯类化合物是白酒中最重要的一类香味成分,其组成和含量与酒体感官、品质密切相关。研究表明微生物合成代谢途径和酶促反应是白酒酿造过程中酯类物质积累的主要生物途径。文章系统总结了白酒酿造过程中酯类化合物的种类,在此基础上,概述了微生物和酯合成酶在风味酯合成方面的研究现状,并对未来风味酯合成的研究方向进行了展望。

关键词：白酒风味酯微生物酯类合成代谢脂肪酶角质酶

一株产L-苹果酸黑曲霉菌株的诱变筛选及发酵培养基优化

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食品工业科技 2024年第8期45卷 165-173页

作者：刘书彤石冰冰谭奕阳厉成伟魏彩霞王德培薛鲜丽天津科技大学生物工程学院天津300457 山东日照金禾博源生化有限公司山东日照276800 工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

为筛选一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,通过紫外诱变与高浓度放线菌酮迭代诱变的方法,将野生型菌株诱变为一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,并对其种子或发酵培养基成分进行优化。结果表明,诱变所得一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉CGM... 详细信息

为筛选一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,通过紫外诱变与高浓度放线菌酮迭代诱变的方法,将野生型菌株诱变为一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,并对其种子或发酵培养基成分进行优化。结果表明,诱变所得一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉CGMCC NO.40550菌株,其摇瓶发酵时种子培养基最适葡萄糖浓度为60 g/L、最适氮源为(NH_4)_2SO_4 4.95 g/L,黑曲霉菌球形成最优转速220 r/min;发酵培养基最适葡萄糖和最适(NH_4)_2SO_4浓度分别为180 g/L和4.95 g/L,Cu SO_4·5H_2O为其生产苹果酸最佳微量元素,最适添加量为0.065 g/L。通过单因素实验的优化,优化后的培养基更有利于L-苹果酸的合成,发酵96 h时L-苹果酸产酸量达到18.15 g/L,显著提高了245%,L-苹果酸占总酸的百分比达到71.69%。本研究为L-苹果酸的工业化生产奠定基础。

关键词：黑曲霉紫外诱变 L-苹果酸摇瓶发酵培养条件

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黑曲霉碱性蛋白酶CpyC的生化特征解析

食品与发酵工业 2024年

作者：程磊王正祥天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院

本文对一种黑曲霉来源的蛋白酶CpyC进行了生化特征解析。该酶在结构与组成上具有丝氨酸蛋白水解酶SB家族特征性催化活性中心，由Asp188、His226和Ser381氨基酸残基组成，序列特征接近丝氨酸蛋白水解酶SB家族S08类，但与现有家族成员分... 详细信息

本文对一种黑曲霉来源的蛋白酶CpyC进行了生化特征解析。该酶在结构与组成上具有丝氨酸蛋白水解酶SB家族特征性催化活性中心，由Asp188、His226和Ser381氨基酸残基组成，序列特征接近丝氨酸蛋白水解酶SB家族S08类，但与现有家族成员分类特征并不完全相同。重组CpyC的最适作用温度和pH分别为50 ℃和8.0，Ca2+和Co2+对其分别具有最强的激活作用和抑制作用，丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂苯甲基磺酰氟对其具有较强抑制作用，可见，黑曲霉蛋白酶CpyC是一种碱性丝氨酸蛋白酶。CpyC水解大豆分离蛋白结果显示，该酶具有水解蛋白质为多肽和寡肽的活性特征，在蛋白质生物加工中可能具有潜在应用价值。

关键词：碱性丝氨酸蛋白酶黑曲霉克隆与表达生化特征蛋白质水解

解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸的研究进展

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生物技术通报 2024年第1期40卷 72-85页

作者：何思成张紫瑗韩雨晴苗琳张翠英于爱群天津科技大学生物工程学院省部共建食品营养与安全国家重点实验室工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津300457

多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用。因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现... 详细信息

多不饱和脂肪酸属直链脂肪酸,是机体生物膜的关键结构组分,它可以调控糖脂代谢及激素代谢,具有促进发育、提高免疫力和预防疾病等多种益生功能,对机体健康具有十分重要的作用。因此,多不饱和脂肪酸在食品、医药和饲料等多个领域均表现出重要的应用价值和广阔的开发前景,市场需求持续上升。与传统的海洋生物提取法相比,微生物合成法具有生产周期短、工艺简单、对环境友好等优势,近年来利用微生物细胞工厂生产多不饱和脂肪酸等微生物油脂逐渐成为科学界和工业界的研究热点和发展趋势。解脂耶氏酵母作为一种非常规产油酵母,因其具备高产油脂和脂肪酸的天然能力,因此成为了代谢工程改造微生物生产多不饱和脂肪酸的首选底盘细胞之一。本文首先介绍了多不饱和脂肪酸的来源及其天然合成途径;然后总结归纳了当前利用代谢工程策略改造解脂耶氏酵母生产多不饱和脂肪酸的研究现状;最后对利用解脂耶氏酵母细胞工厂生产多不饱和脂肪酸存在的主要瓶颈问题和未来发展趋势进行了探讨,期望为未来高效合成多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂的构建提供理论支持与思路。

关键词：多不饱和脂肪酸微生物细胞工厂解脂耶氏酵母产油酵母代谢工程

基于转录调节因子PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的构建与优化

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生物工程学报 2024年

作者：刘俊杰蒋敏敏孙彤孙祥祥赵咏灿顾明霞路福平黎明工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4... 详细信息

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4-丁二胺生物传感器的广泛适用。本研究开发了一种以转录调节因子PuuR为基础的1，4-丁二胺生物传感器，其同源的操作子puuO被安装在大肠杆菌组成型启动子PgapA中，以控制下游的高能绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein， sfGFP）作为报告蛋白表达。采用大肠杆菌基因组中不同强度的启动子对1，4-丁二胺生物传感器进行分子改造，探究并改进基于PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的功能性质，为高通量筛选高产1，4-丁二胺的工程菌株奠定基础。

关键词：大肠杆菌 1,4-丁二胺生物传感器转录调节因子PuuR

基于异源表达和甲基化修饰制备抗自切重组胰蛋白酶

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微生物学报 2024年

作者：于文娟许伟洲孙娜娜孙颖李玉强杨霁菡路福平王洪彬天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【... 详细信息

广泛应用的胰蛋白酶制剂，目前主要从动物胰脏提取，具有原料受限、成本高和纯度低等缺点。此外，胰蛋白酶的自切降解也影响了其在储存和应用中的稳定性。【目的】通过毕赤酵母异源表达和甲基化修饰制备获得新型抗自切重组胰蛋白酶。【方法】通过基因重组技术实现猪胰蛋白酶酶原在毕赤酵母中的异源表达；通过单因素试验对酶原激活的温度、pH和时间进行考察和优化；通过探索甲基化修饰方法提高重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结果】成功构建了胰蛋白酶酶原的毕赤酵母工程菌株，优化了酶原的肠激酶激活条件，考察了胰蛋白酶浓度、甲基化试剂添加量和反应时间对甲基化效果的影响，在胰蛋白酶浓度10 mg/mL，甲基化试剂添加量30 μL，反应时间3 h条件下，所获甲基化酶在酶活损失仅22%情况下，自切6 h酶活保留率提高达到了79%，相比对照提高了约3.4倍，大幅提高了重组胰蛋白酶的抗自切性能。【结论】本研究基于异源表达和甲基化修饰成功制备了新型抗自切重组胰蛋白酶，该成果有助于提高我国胰蛋白酶的生产和应用水平。

关键词：胰蛋白酶甲基化抗自切