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UPRE-lac Z为报告基因评价酵母UPR响应初步研究

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中国生物工程杂志 2020年第10期40卷 1-9页

作者：章小毛郭敬涵洪解放陆海燕丁娟娟邹少兰范寰天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学石化中心天津300072 天津市畜牧兽医研究所天津300381

目的:未折叠蛋白质反应UPR是酵母最重要蛋白质质量控制机制之一,研究UPR响应规律有助于优化异源蛋白分泌途径合成和应对酸醇等胁迫因子的细胞自我保护。方法:选择实验室菌株W303-1A和工业菌株An-a,以UPRE启动子控制下的Lac Z为报告基因... 详细信息

目的:未折叠蛋白质反应UPR是酵母最重要蛋白质质量控制机制之一,研究UPR响应规律有助于优化异源蛋白分泌途径合成和应对酸醇等胁迫因子的细胞自我保护。方法:选择实验室菌株W303-1A和工业菌株An-a,以UPRE启动子控制下的Lac Z为报告基因,利用CRISPR/Cas9技术构建得到指示菌株W303-1A(leu 2∷UPRE-lac Z)和An-a(leu 2∷UPRE-lac Z),分别简称WZ和AZ。结果:生长曲线测定显示WZ和AZ与亲本菌株的生长接近;添加下述试剂孵育4h后测定β-半乳糖苷酶酶活:1μg/ml衣霉素、8%(v/v)乙醇、0.3%(v/v)乙酸、5%(v/v)乙醇+0.1%(v/v)乙酸;菌株AZ的比酶活分别是对照值的8.2、26.4、1.1和7.9倍,而菌株WZ则分别为12.6、2.4、1.0和1.0倍;进一步以YEplac195为载体表达β-葡萄糖苷酶,AZ和WZ转化子在2%纤维二糖中生长24h的β-葡萄糖苷酶酶活值分别为0.35和6.12U/ml,相应的LacZ则分别为对照值的3.1和5.4倍。结论:两个菌株显示了在抑制物和异源蛋白表达UPR响应和调控能力上的显著差异,为其改造利用提供了方向;研究也为分析抑制物耐受性和异源蛋白表达关键制约因素、优化酵母ER和UPR信号通路的调控奠定了初步方法基础。

关键词：酿酒酵母 UPRE-lacZ UPR响应抑制物分泌表达

过表达羧化途径及失活苹果酸酶基因对大肠杆菌好氧发酵产苹果酸的影响

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生物工程学报 2016年第11期32卷 1539-1548页

作者：娄菲李宁赵玉姣果士婷王智文陈涛天津大学化工学院教育部系统生物工程重点实验室天津300072 天津化学化工协同创新中心天津300072

苹果酸是一种重要的C4二羧酸,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文主要研究羧化途径强化及苹果酸酶失活对大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的影响。首先在大肠杆菌E2中过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,得到菌株E21,苹果酸积... 详细信息

苹果酸是一种重要的C4二羧酸,在食品、医药、化工等领域有广泛的应用。本文主要研究羧化途径强化及苹果酸酶失活对大肠杆菌好氧发酵生产苹果酸的影响。首先在大肠杆菌E2中过表达了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc,得到菌株E21,苹果酸积累量从0.57 g/L提高到3.83 g/L。随后,分别过表达来自谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶基因pyc和来自琥珀酸放线杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck基因,相应的工程菌株E21(pTrcpyc)和E21(pTrc-A-pck)分别产6.04和5.01 g/L苹果酸,得率分别达到0.79和0.65 mol/mol葡萄糖。敲除E21中的苹果酸酶基因mae A和mae B,苹果酸产量也显著提高了36%,达到5.21 g/L,得率为0.62 mol/mol。然而,在过表达pyc的基础上敲除苹果酸酶基因并不能进一步提高苹果酸的产量。经过摇瓶发酵条件的初步优化,菌株E21(pTrcpyc)生产12.45 g/L苹果酸,得率为0.84 mol/mol,达到理论得率的63.2%。

关键词：大肠杆菌代谢工程苹果酸苹果酸酶羧化途径

环磷酸腺苷生产酵母菌株不同阶段RNA的提取改进

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食品与发酵工业 2020年第24期46卷 1-8页

作者：李佳蔓章小毛郭敬涵孙思凡贾玉蝶邹少兰天津大学化工学院天津300072 系统生物工程教育部重点实验室天津300072 发酵技术国家工程研究中心(天津) 天津300072

考察了环磷酸腺苷(cyclic adenosine monphosphate,cAMP)生产酵母菌株G2在YPD培养基中不同生长阶段的总RNA提取效果,并进行了初步改进研究。选择16 h对数生长期、36 h二次生长期和60 h稳定期细胞,分别用试剂盒提取,RNA得率依次为1010.6... 详细信息

考察了环磷酸腺苷(cyclic adenosine monphosphate,cAMP)生产酵母菌株G2在YPD培养基中不同生长阶段的总RNA提取效果,并进行了初步改进研究。选择16 h对数生长期、36 h二次生长期和60 h稳定期细胞,分别用试剂盒提取,RNA得率依次为1010.6、171.5和91.3 ng/A 600。选择高、低丰度表达基因ACT 1和CYR 1进行实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR),同时判断DNA污染情况;琼脂糖电泳和RNA完整值(RNA integrity number,RIN)测定判断完整性。结果显示,36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染,仅16 h样品能满足RNA测序要求。进一步对比了5种破壁方法在破碎细胞及相应RNA提取上的效果,添加珠打破壁步骤破碎细胞效果最好,显示对16 h细胞RNA提取效果没有明显变化,但36 h和60 h细胞的RNA得率分别提高至979.6和785.6 ng/A 600,为前述值的5.71倍和8.60倍,且纯度能满足qRT-PCR要求,36 h样品能满足RNA测序要求。该研究有助于推动建立酵母生长全阶段RNA分析技术和深化cAMP相关途径调控机制的认识。

关键词：酵母生长阶段 RNA提取珠打

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SEDS蛋白的结构与功能研究进展

中国细胞生物学学报 2020年第6期42卷 1053-1062页

作者：李晨辰吴昊田开仁乔建军李艳妮天津大学化工学院制药工程系天津300072 天津大学系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学教育部前沿科学中心天津300072

肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分,在维持细胞活性、形状和保护渗透压等方面起着重要作用。SEDS(shape,elongation,division,and sporulation)蛋白是参与肽聚糖合成的一类膜蛋白家族,其成员与细胞形状、伸长、分裂和孢子形成有关。一系列... 详细信息

肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分,在维持细胞活性、形状和保护渗透压等方面起着重要作用。SEDS(shape,elongation,division,and sporulation)蛋白是参与肽聚糖合成的一类膜蛋白家族,其成员与细胞形状、伸长、分裂和孢子形成有关。一系列遗传和生化证据表明,SEDS蛋白具有糖基转移酶功能,是细胞延长和分裂机制的核心聚合酶。SEDS蛋白分布的广泛性、结构的保守性和功能的重要性,使其有望成为新一代抗生素研究的重要靶标。该文对SEDS蛋白的结构和功能进行了综述,重点介绍了SEDS蛋白的结构及其参与肽聚糖合成的调控机制,并对SEDS蛋白的应用和前景进行了展望。

关键词：肽聚糖 SEDS RodA FtsW SpoVE

多质粒共转化组合筛选方法构建木糖利用酿酒酵母的研究

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中国生物工程杂志 2016年第12期36卷 86-97页

作者：刘宝利刘高冈林秋卉李炳志元英进天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心天津300072

快速得到目标代谢路径相关基因的大量组合以及实现组合库的高效筛选,是合成生物学领域中一个重要的研究内容。建立了三质粒共转化酵母菌株组合筛选方法并以XR-XDH木糖代谢路径在酿酒酵母中的应用为例进行阐释。首先利用Yeast Golden Gat... 详细信息

快速得到目标代谢路径相关基因的大量组合以及实现组合库的高效筛选,是合成生物学领域中一个重要的研究内容。建立了三质粒共转化酵母菌株组合筛选方法并以XR-XDH木糖代谢路径在酿酒酵母中的应用为例进行阐释。首先利用Yeast Golden Gate连接法在三种不同表达载体上构建不同启动子控制下的XR、XDH、XK单个基因的表达盒,然后直接用三质粒共转化系统构建100种不同组合的重组酵母。经过木糖平板初筛筛选出16个能利用木糖的组合,将这16个组合对应的三基因表达模块组装至同一表达载体后转化底盘菌株,再通过限氧发酵进行复筛,最终筛选出木糖代谢能力、木糖醇和乙醇生成速率最优菌株Sc-LQH35(TDH3p-XR-ACS2t-FBA1pXDH-ENO2t-PDC1p-XK-ASC1t),在培养基中含有20 g/L木糖的条件下,其木糖醇产量为7.14g/L,乙醇产量为5.92 g/L,而菌株Sc-LQH39(TDH3p-XR-ACS2t-FBA1p-XDH-ENO2t-ZEO1p-XKASC1t)则表现出较强的木糖醇生产能力,特别在限氧发酵时,其木糖醇得率可高达0.71 g/g。三质粒共转化组合筛选方法实现了木糖利用菌株的灵活构建和快速筛选,并成功得到具有优良木糖利用性能的酿酒酵母菌株,表明其在重组菌株的构建和筛选工作中有一定的应用价值。

关键词：合成生物学酿酒酵母共转化组合筛选木糖利用

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维生素A生物合成的研究进展

化工学报 2022年第10期73卷 4311-4323页

作者：王欣慧王颖姚明东肖文海天津大学化工学院天津300072 天津大学合成生物学前沿科学中心和系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学前沿技术研究院天津301700

维生素A是维持人体代谢的必需维生素,在食品、药品及护肤品等多个领域占有重要地位,是三大维生素支柱产品之一,应用前景广阔。市场上的维生素A主要来源于化学合成和天然提取。近年来,随着绿色生物制造的发展,维生素A的生物合成研究取得... 详细信息

维生素A是维持人体代谢的必需维生素,在食品、药品及护肤品等多个领域占有重要地位,是三大维生素支柱产品之一,应用前景广阔。市场上的维生素A主要来源于化学合成和天然提取。近年来,随着绿色生物制造的发展,维生素A的生物合成研究取得了重大的进展。总结了维生素A生物合成的研究现状,并对维生素A生物合成的优化改造方案进行了分析归纳,概述了维生素A发酵生产以及产品组分调控和储存策略,最后对生物合成维生素A的现状进行总结与展望。

关键词：维生素A 细胞工厂合成生物学视黄醇酶代谢

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VC三菌种一步发酵方法的构建与研究

中国生物工程杂志 2016年第12期36卷 72-78页

作者：翟兵兵董秀涛丁明珠元英进天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心天津300072

就维生素C微生物一步发酵方法进行了探索,构建了酮古龙酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌三菌混菌一步发酵的方法。研究发现,植物内生芽孢杆菌可以与酮古龙酸杆菌配合,促进酮古龙酸杆菌生长和产酸。在有山梨醇存在的条件下酮古龙酸杆... 详细信息

就维生素C微生物一步发酵方法进行了探索,构建了酮古龙酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌三菌混菌一步发酵的方法。研究发现,植物内生芽孢杆菌可以与酮古龙酸杆菌配合,促进酮古龙酸杆菌生长和产酸。在有山梨醇存在的条件下酮古龙酸杆菌及其伴生菌能够快速地生长增殖,植物内生芽孢杆菌在发酵的10h中不断消耗山梨醇。5L的发酵罐中,酮古龙酸杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌和植物内生芽孢杆菌三菌混菌一步发酵在恒定的30℃温度,600r/min搅拌速度和1.5vvm通气条件下,补料发酵过程中醇酸质量转化率达到了81.89%,在分批发酵过程中,醇酸质量转化率达到了87.90%,进一步优化了维生素C生产工艺。

关键词：芽孢杆菌酮古龙酸杆菌氧化葡萄糖酸杆菌三菌一步发酵

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柔性化、智能化、自动化细胞工厂

生物加工过程 2023年第5期21卷 494-506页

作者：周嗣杰郑妍丁明珠元英进天津大学化工学院教育部合成生物学前沿科学中心系统生物工程教育部重点实验室天津300072 天津大学合成生物前沿研究院天津300072

“合成生命,设计生命”是合成生物学与生物制造的重要使命,通过按需设计、化学再造人工基因组,实现人工细胞工厂的精准构建。当前细胞工厂面临代谢网络复杂、缺乏理性设计、试错成本高、底盘生物改造周期长等瓶颈问题,限制了细胞工厂的... 详细信息

“合成生命,设计生命”是合成生物学与生物制造的重要使命,通过按需设计、化学再造人工基因组,实现人工细胞工厂的精准构建。当前细胞工厂面临代谢网络复杂、缺乏理性设计、试错成本高、底盘生物改造周期长等瓶颈问题,限制了细胞工厂的应用。基于合成基因组学的柔性生物底盘,集成机器学习辅助智能设计、自动化高通量构建检验是潜在的解决途径,三者融合将构建下一代柔性化、智能化、自动化细胞工厂,打造分子生物合成的研发新范式,极大加速设计—合成—测试—优化的循环迭代,实现高价值目标分子的按需设计与快速生产。本文结合笔者近年在细胞工厂构建方面的研究工作,从国内外细胞工厂柔性化、智能化、自动化等方面进行综述,并展望未来发展趋势。

关键词：合成生物学柔性化智能化自动化基因组重排

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谷胱甘肽对VC一步发酵作用的研究

中国生物工程杂志 2016年第8期36卷 38-45页

作者：翟兵兵马倩丁明珠元英进天津大学化工学院系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心天津300072

谷胱甘肽(GSH)能有效促进酮古龙酸杆菌的生长。就GSH对氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌一步混菌发酵的作用进行了探索,为进一步阐明维生素C一步发酵过程中氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌的关系并提供发酵工艺优化的依据。研究发现,在5... 详细信息

谷胱甘肽(GSH)能有效促进酮古龙酸杆菌的生长。就GSH对氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌一步混菌发酵的作用进行了探索,为进一步阐明维生素C一步发酵过程中氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌的关系并提供发酵工艺优化的依据。研究发现,在5L的发酵罐中,外加1mg/ml的GSH对混菌的发酵有着显著的促进作用,2-酮-L-古龙酸(2-KGA)产量提高了22.8%。通过16S r DNA荧光定量PCR法测菌数,发现GSH的添加使酮古龙酸杆菌的生长提高到148%,但抑制氧化葡萄糖酸杆菌的生长,使其生物量下降到61%。运用代谢组学方法分析发现,GSH能促进酮古龙酸杆菌的磷酸戊糖、三羧酸循环、硫酸盐等代谢,同时减缓氧化葡萄糖酸杆菌对L-山梨糖的消耗,以促进整个混菌体系的发酵效率。

关键词：谷胱甘肽酮古龙酸杆菌氧化葡萄糖酸杆菌代谢组学