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鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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水产学报 2016年第3期40卷 363-370页

作者：付小哲李宁求林强刘礼辉吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞... 详细信息

为了建立鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)疫苗抗原含量的ELISA检测方法,制备了3株抗ISKNV主衣壳蛋白(MCP)的单克隆抗体,鉴定了其生物学特性。将大肠杆菌表达的重组MCP纯化复性后,连续3次免疫BALB/c小鼠,然后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆、筛选,获得3株能稳定分泌抗ISKNV MCP蛋白的单克隆抗体阳性细胞株,分别命名为5F1、3D9和5B4,均为Ig G1亚型。间接ELISA实验表明,3株单抗可特异性识别ISKNV,与鳜弹状病毒、大鲵虹彩病毒等无交叉反应。将5F1株免疫小鼠后制备腹水,以重组MCP和ISKNV细胞培养物上清液为检测抗原,ELISA检测腹水效价分别为1∶51 200和1∶400。间接免疫荧光(IFA)和Western Blotting鉴定结果显示,5F1能够与ISKNV病毒发生特异性反应,并初步确定5F1单抗株制备的腹水用于IFA的使用浓度为1∶200、Western Blotting的使用浓度为1∶1000。结果证实,成功制备了抗ISKNV MCP的单克隆抗体,可特异性识别ISKNV病毒粒子和MCP蛋白,为建立ISKNV疫苗抗原含量检测方法奠定了基础。

关键词：鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体

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鱼源溶藻弧菌生物学特性和病理组织学观察

微生物学报 2014年第11期54卷 1378-1384页

作者：赖迎迢陶家发孙承文石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380

【目的】溃烂病是我国海水养殖及南方养殖斜带石斑鱼的常见严重病害之一。通过对患病的斜带石斑鱼病原菌的分离与鉴定,为检测其耐药性和控制石斑鱼在海水养殖中溃烂病的爆发和流行奠定基础。本文目的是研究斜带石斑鱼相关的病原菌的特... 详细信息

【目的】溃烂病是我国海水养殖及南方养殖斜带石斑鱼的常见严重病害之一。通过对患病的斜带石斑鱼病原菌的分离与鉴定,为检测其耐药性和控制石斑鱼在海水养殖中溃烂病的爆发和流行奠定基础。本文目的是研究斜带石斑鱼相关的病原菌的特性。【方法】从患病斜带石斑鱼肾脏、肝脏病灶组织,分离纯化得到病原菌,进行纯化培养、人工感染和回归感染、ATB细菌自动鉴定及药敏试验,并进行菌体常规形态特征、培养特性和生理生化反应指标测定。【结果】确定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。两株典型菌株经人工感染和回归感染均显示自然发病症状。药敏试验表明,该菌具有较强的耐药性,在所检测的抗菌药物中,对青霉素等3类抗菌药物高度耐药,而对氯霉素等5类抗菌药物敏感。器官主要组织病理学变化为:肝细胞、肾小管细胞等变性、坏死,病变组织有炎性细胞浸润且呈变质性炎症。溶藻弧菌对机体的主要器官造成严重病理损伤。【结论】生理生化等结果均证实分离菌株是溶藻弧菌,而且产生多重耐药情况较为普遍,未来应加强对养殖海水中病原耐药性和斜带石斑鱼病原感染的监测。

关键词：斜带石斑鱼溶藻弧菌弧菌鉴定

鳢流行性溃疡综合征病原分离鉴定与病理形态学观察

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中国水产科学 2019年第6期26卷 1213-1220页

作者：常藕琴石存斌王亚军刘春陈绮梨霍礼侠中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为寻找冬春季鳢(Channa maculata)烂身病的病原,应用组织压片、组织切片、扫描电镜技术、HE常规染色法和Grocott六胺银染色法、霉菌分离纯化及ITS的序列分析等对冬春季患疑似溃疡综合征的烂身病鳢进行了病原学与病理学研究。病变组织压... 详细信息

为寻找冬春季鳢(Channa maculata)烂身病的病原,应用组织压片、组织切片、扫描电镜技术、HE常规染色法和Grocott六胺银染色法、霉菌分离纯化及ITS的序列分析等对冬春季患疑似溃疡综合征的烂身病鳢进行了病原学与病理学研究。病变组织压片观察到大量直径10～20μm,分枝较少、纤细菌丝。扫描电镜观察到肌肉组织中延伸出大量的纤细的丝状真菌。患病鳢皮肤和肌肉表现为变性、坏死与炎性细胞浸润,溃疡灶肌肉内可见大量的慢性肉芽肿结节和炎性细胞浸润。结节基本结构由类上皮细胞和多核巨细胞、炎性细胞、霉菌菌丝(横断面呈圆形,斜断或纵断呈丝状)组成,霉菌位于结节中央。Grocott六胺银染色观察到结节中有大量棕色菌体。无菌分离培养可观察到典型丝状霉菌;霉菌在灭菌池塘水20℃过夜, 12 h后可观察原代孢子群形成,真菌ITS序列分析表明其与侵袭丝囊菌(Aphanomyces invadans)同源性为100%。侵袭丝囊霉菌(A. invadans)是杂交鳢溃疡综合症病的主要病原,为鱼类流行病学调查和疾病防治的深入研究奠定基础。

关键词：鳢流行性溃疡综合征丝囊霉菌病理形态学

贝莱斯芽孢杆菌LF01基因组序列分析及其代谢产物的生防作用

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水产学报 2022年第2期46卷 196-206页

作者：张德锋高艳侠可小丽王亚军任燕石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室

为充分挖掘贝莱斯芽孢杆菌LF01菌株拮抗物质合成相关基因簇，实验对其进行了全基因组测序与分析，同时评价了LF01菌株拮抗物质的生物安全性及其生防作用效果。基于三代Nanopore测序平台对LF01菌株进行全基因组测序分析，并利用在线平均... 详细信息

为充分挖掘贝莱斯芽孢杆菌LF01菌株拮抗物质合成相关基因簇，实验对其进行了全基因组测序与分析，同时评价了LF01菌株拮抗物质的生物安全性及其生防作用效果。基于三代Nanopore测序平台对LF01菌株进行全基因组测序分析，并利用在线平均核苷酸同源性(ANI)和DNA-DNA杂交(DDH)分析，以及基因组遗传进化确定该菌株的分类学地位；通过antiSMASH在线分析LF01基因组中的拮抗物质合成基因簇。同时，基于CAZyme数据库分析LF01菌株对糖类物质的水解能力。LF01菌株拮抗物质通过腹腔注射的方式，检测其对尼罗罗非鱼和斑马鱼的致病性；拮抗物质饲喂尼罗罗非鱼后评价其生防作用效果。结果显示，LF01菌株基因组全长为3 974 023 bp,GC含量为46.56%，包含3 843个编码基因。LF01菌株与贝莱斯芽孢杆菌的ANI和DDH分别≥97.66%和≥80.10%，同时基于SNP进化分析显示，该菌与贝莱斯芽孢杆菌聚为一支，表明LF01菌株在基因组分子水平上被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。LF01菌株包含了bacillaene、bacillibactin、杆菌霉素D(bacillomycin D)、溶杆菌素(bacilysin)、difficidin、泛革素(fengycin)、macrolactin H、plantazolicin和表面活性素(surfactin)等9个拮抗物质基因簇，约占基因组全长的8.83%。LF01菌株基因组中含有许多与纤维素、半纤维素、淀粉、几丁质、果胶、肽聚糖和葡聚糖降解有关的CAZy酶基因家族。LF01的拮抗物质对尼罗罗非鱼和斑马鱼具有较高的安全性，而且饲喂尼罗罗非鱼后能够显著提高其对无乳链球菌的抗病力。综上可知，LF01菌株含有大量拮抗物质合成基因簇，其拮抗物质具有较高的生物安全性，并且饲喂后能够显著提高尼罗罗非鱼的抗病力，表明LF01菌株拮抗物质在水产动物细菌性疾病的防控方面具有良好的开发应用前景。

关键词：贝莱斯芽孢杆菌基因组测序拮抗物质生防作用

罗非鱼无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗制备及其免疫效果的研究

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南方水产科学 2019年第6期15卷 9-18页

作者：袁玉梅石存斌陶家发张德锋孙承文巩华黄志斌赖迎迢中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为研制比无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)单个蛋白抗原免疫效果更佳的多蛋白重组罗非鱼(Oreochromis sp.)链球菌病口服疫苗,该研究利用同源重组法构建表达无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白的pNZ8148-sippgk质粒,通过电转化乳酸乳球菌(La... 详细信息

为研制比无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)单个蛋白抗原免疫效果更佳的多蛋白重组罗非鱼(Oreochromis sp.)链球菌病口服疫苗,该研究利用同源重组法构建表达无乳链球菌Sip-Pgk融合蛋白的pNZ8148-sippgk质粒,通过电转化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中获得*** NZ9000 pNZ8148-sip-pgk重组乳酸菌,使用nisin诱导表达并进行Western blot鉴定,制备Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌口服疫苗,通过不同免疫次数隔周免疫的方式灌胃罗非鱼。ELISA检测免疫后的血清抗体水平,在灌胃免疫结束后的第18天通过腹腔注射无乳链球菌攻毒获得相对免疫保护率。结果显示,构建的重组乳酸菌诱导表达的蛋白大小为92 kD,与目的蛋白大小一致。与2次免疫比较,3次免疫该融合蛋白乳酸菌疫苗能显著提高罗非鱼的血清抗体水平和对无乳链球菌的免疫保护效果。3次免疫Sip-Pgk融合蛋白乳酸菌疫苗的血清水平显著高于单一蛋白组和PBS组,其相对免疫保护率最高(45.56%)。

关键词：罗非鱼无乳链球菌乳酸菌疫苗融合蛋白免疫

基于“天河二号”的水产病原生物信息分析平台构建及其在水产病原分析中的应用

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遗传 2015年第7期37卷 702-710页

作者：方翔李宁求付小哲李凯彬林强刘礼辉石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380

作为生命科学的关键组成,生物信息学已被广泛地应用于基因组学、转录组学和蛋白质组学中。然而,生物信息分析平台的构建需要高性能计算机而非普通的个人电脑,从而极大地限制了生物信息学在水产科学中的应用。本研究基于"天河二号"超级... 详细信息

作为生命科学的关键组成,生物信息学已被广泛地应用于基因组学、转录组学和蛋白质组学中。然而,生物信息分析平台的构建需要高性能计算机而非普通的个人电脑,从而极大地限制了生物信息学在水产科学中的应用。本研究基于"天河二号"超级计算机,构建了水产病原生物信息分析平台。该平台由基因组与转录组测序数据分析、蛋白质结构预测和分子动力学模拟3个功能模块组成。为了验证该平台的实用性,以水生动物病原微生物为例进行了生物信息学分析。通过Blast检索、GO和Inter Pro注释,鉴定了约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)M168株的功能基因并对其进行了注释。通过同源模建,构建了草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)HZ-08的5个小节段的蛋白结构模型。对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白A进行了分子动力学模拟,并观察了平衡过程中系统温度、总能量、均方根偏差和环区构象的变化。以上结果均显示本研究成功建立了在"天河二号"超级计算机上运行的水产病原生物信息分析平台。此项研究将为其他学科生物信息分析平台的构建提供思路和线索。

关键词：生物信息学天河二号水产病原

4种中草药单体对嗜热四膜虫生长和凋亡的影响

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南方水产科学 2021年第6期17卷 66-73页

作者：潘厚军康佳磊张德锋常藕琴任燕王亚军蒋俊贤王琳石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380

利用Hoechst 33258荧光染色、活细胞计数、CCK-8细胞活力测定、抗氧化酶活力测定等技术,研究了青蒿素、大黄素、芦荟大黄素、小檗碱(又名黄连素)等4种中草药单体对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)生长和凋亡的影响,为应用嗜热四膜... 详细信息

利用Hoechst 33258荧光染色、活细胞计数、CCK-8细胞活力测定、抗氧化酶活力测定等技术,研究了青蒿素、大黄素、芦荟大黄素、小檗碱(又名黄连素)等4种中草药单体对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)生长和凋亡的影响,为应用嗜热四膜虫筛选抗鱼寄生虫中草药提供参考。结果表明,采用Hoechst荧光染色,4种单体在高浓度(20~200 mg·L^(−1))作用下均可使嗜热四膜虫凋亡,显著着色发亮。4种单体对嗜热四膜虫的半抑制浓度(IC50)和95%置信区间(95%confidence interval,95%CI),用细胞计数法测定依次为21.23(16.71~28.23)mg·L^(−1)、3.77(1.91~5.54)mg·L^(−1)、1.70(0.18~3.82)mg·L^(−1)和44.56(29.82~98.66)mg·L^(−1),CCK-8细胞活力测定法依次为20.03(13.02~28.45)mg·L^(−1)、6.07(4.39~7.65)mg·L^(−1)、3.67(2.61~4.72)mg·L^(−1)和107.39(66.78~267.17)mg·L^(−1),CCK-8法与细胞计数法所呈现的趋势较为一致。在单体质量浓度为1.25~50.0 mg·L^(−1),随着药物浓度的增加,过氧化氢酶(CAT)活力有升高趋势,而丙二醛(MDA)呈下降趋势,超氧化物歧化酶(SOD)活力先升高后降低。上述结果表明,4种中草药单体对嗜热四膜虫的生长和凋亡有剂量效应关系,凋亡的产生可能与细胞氧化应激状态改变有关。

关键词：中草药单体嗜热四膜虫细胞凋亡半抑制浓度氧化应激

猪–鱼复合养殖模式中气单胞菌I类整合子的流行情况及其耐药特征

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水产学报 2016年第1期40卷 92-99页

作者：冯永永姜兰邓玉婷谭爱萍张瑞泉罗理中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶... 详细信息

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶基因intI1,并分析其基因盒阵列结构。结果表明,317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高。intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个Ⅰ类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因bla;、bla;,氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac（6’）-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。研究表明,I类整合子分布于广东地区猪-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。

关键词：气单胞菌复合养殖模式 I类整合子耐药

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草鱼肾中性粒细胞的分离鉴定与活性检测

中国水产科学 2021年第12期28卷 1515-1522页

作者：常藕琴霍礼霞罗满林石存斌张德峰潘厚军任燕中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室华南农业大学

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性,目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞;应用迪夫氏... 详细信息

分离纯化草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾中性粒细胞、鉴定和检测其活性,目的在于为研究中性粒细胞的功能和免疫防御机制提供细胞材料。本研究使用鱼类脏器组织中性粒细胞分离试剂盒和差异贴壁法分离获得草鱼肾中性粒细胞;应用迪夫氏染色、碘化钾-吡啰红G (KI-Py G)染色、电镜技术鉴定细胞形态,使用多功能酶标仪检测经MPA刺激的细胞活性,台盼蓝染色法和CCK-8检测细胞存活率。结果显示,获得的细胞大小均一,细胞核圆形或肾形,胞质有A、B型颗粒,表面有皱褶,具有中性粒细胞的形态特征;细胞纯度达(99.3±0.53)%,细胞活力达(97.70±0.76)%,在体外培养24h内细胞存活率可保持在(89.91±3.56)%;在PMA刺激下检测到细胞表达MPO、ROS、NO和NETs的量显著提高(P研究成功建立草鱼中性粒细胞的分离方法,细胞具有很好的活力,可为深入研究鱼类中性粒细胞的功能和免疫机制提供基础。

关键词：草鱼中性粒细胞分离鉴定活性检测