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PGE通过EP4/PKA信号通路调控滑膜细胞OAT1的表达及CP-25的作用

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中国药理学通报 2024年 1658-1664页

作者：肖康俊高锦张王勇王斌魏伟王春安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室安徽省抗炎免疫药物协同创新中心

目的明确前列腺素E2 （prostaglandin E2,PGE2）对滑膜细胞有机阴离子转运体1 （organic anion transporter 1,OAT1）膜表达的调控机制及芍药苷-6'-O-苯磺酸酯（CP-25）的作用。方法免疫荧光法检测不同浓度CP-25对PGE2处理后滑膜细胞O... 详细信息

目的明确前列腺素E2 （prostaglandin E2,PGE2）对滑膜细胞有机阴离子转运体1 （organic anion transporter 1,OAT1）膜表达的调控机制及芍药苷-6'-O-苯磺酸酯（CP-25）的作用。方法免疫荧光法检测不同浓度CP-25对PGE2处理后滑膜细胞OAT1和前列腺素E受体4 （prostaglandin E receptor 4,EP4）表达的影响;使用EP4激动剂（TCS2510）与拮抗剂（GW627368X）,探究EP4在OAT1调节中的作用;使用CP-25和蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）抑制剂H-89,探究CP-25和PKA对滑膜细胞OAT1表达的影响。结果PGE2在0～10 min内明显下调EP4与OAT1的膜表达,20～60 min后明显上调（P <0.05）;CP-25明显上调PGE2处理后细胞膜OAT1和EP4的表达（P <0.05）;EP4激动剂TCS2510明显上调细胞膜OAT1的表达（P <0.01）;CP-25上调PGE2处理的细胞中OAT1的表达,GW627368X和H-89均能下调PGE2和CP-25处理的滑膜细胞中OAT1的表达（P<0.01）。结论 PGE2介导的EP4/PKA信号通路可以调控OAT1在滑膜细胞膜上的表达,CP-25可以通过活化EP4/PKA信号通路明显上调滑膜细胞中OAT1的膜表达。

关键词：芍药苷-6'-O-苯磺酸酯滑膜细胞有机阴离子转运蛋白1 前列腺素E2 前列腺素E受体4 蛋白激酶A

CP-25通过抑制GRK2活性改善小鼠骨关节炎的机制

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中国药理学通报 2024年第5期40卷 936-944页

作者：王惠敏王旭蕾储柱平郭婷婷徐诺王康李颖魏伟严尚学安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室安徽省抗炎免疫药物协同创新中心安徽合肥230032 安徽医科大学实验动物中心安徽合肥230032

目的研究芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(CP-25)通过抑制GRK2活性对骨关节炎(osteoarthritis,OA)小鼠膝关节软骨的保护作用。方法内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus,DMM)手术诱导构建小鼠骨关节炎模型,实验分为假手术组、... 详细信息

目的研究芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(CP-25)通过抑制GRK2活性对骨关节炎(osteoarthritis,OA)小鼠膝关节软骨的保护作用。方法内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus,DMM)手术诱导构建小鼠骨关节炎模型,实验分为假手术组、模型组、CP-25给药组和帕罗西汀给药组。术后开始灌胃给药。给药12周处死动物,Micro-CT成像观察膝关节软骨退变、骨重塑异常等情况,番红固绿染色观察小鼠关节组织病理,免疫组化、免疫荧光检测软骨组织相关分子表达水平的影响。Western blot检测CP-25用药后软骨细胞的膜蛋白及总蛋白表达水平。结果模型小鼠关节软骨严重退变。CP-25可显著降低关节软骨骨赘数量及软骨下板厚度,促进软骨基质再生,减少软骨基质降解蛋白表达,对膝关节软骨有明显的保护作用。免疫组化和免疫荧光结果显示,CP-25治疗可显著降低膝关节组织中GRK2、ADAMTS5、MMP13的表达,并且升高膝关节组织中ColⅡ、Aggrecan表达。体外实验结果表明,CP-25给药可以显著降低GRK2的膜蛋白及总蛋白表达水平,升高EP4膜蛋白水平,降低MMP13水平。结论CP-25给药可显著促进OA小鼠关节软骨基质再生,减少软骨基质降解,对OA具有治疗作用,其机制与抑制GRK2介导的软骨基质代谢有关。

关键词：骨关节炎软骨保护 CP-25 软骨细胞 GRK2 DMM手术

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犬尿氨酸3-单加氧酶在疾病中的作用及其靶向药物研究进展

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药学学报 2024年第5期59卷 1101-1112页

作者：王燚魏伟常艳安徽医科大学临床药理研究所/抗炎免疫药物教育部重点实验室/安徽省抗炎免疫药物协同创新中心/安徽医科大学类风湿关节炎研究中心安徽合肥230000

犬尿氨酸3-单加氧酶(kynurenine 3-monooxygenase,KMO)是机体犬尿氨酸代谢途径(kynurenine pathway,KP)分解代谢下游的一种关键限速酶。在KMO催化下,中间产物犬尿氨酸被代谢为多种活性代谢物,包括3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine,3-HK)、喹啉酸(quinolinicacid,QA)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)等。越来越多的研究表明,KMO表达活性异常介导KP代谢紊乱,参与了神经系统疾病、自身免疫病、感染性疾病及肿瘤等的发生发展,提示其可作为一个潜在、有效的药物治疗靶点。本文重点介绍KMO在多种疾病病理机制中的作用,并总结了已有的KMO抑制剂,为靶向KMO治疗提供方法和思路。

关键词：犬尿氨酸3-单加氧酶犬尿氨酸途径肿瘤神经系统免疫系统

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蓝斑核参与抑郁导致的慢性疼痛行为的调控

安徽医科大学学报 2024年 1517-1524页

作者：袁溪刘雨晴孟浅安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省协同创新中心

目的探究蓝斑核（LC）是否参与介导小鼠抑郁伴疼痛行为及可能机制。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组和慢性束缚应激（CRS）组,通过新奇抑制进食、悬尾和强迫游泳等行为学实验检测抑郁样行为的形成,评估小鼠CRS模型的建立;使用Von ... 详细信息

目的探究蓝斑核（LC）是否参与介导小鼠抑郁伴疼痛行为及可能机制。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组和慢性束缚应激（CRS）组,通过新奇抑制进食、悬尾和强迫游泳等行为学实验检测抑郁样行为的形成,评估小鼠CRS模型的建立;使用Von Frey毛刷检测小鼠的机械痛阈;通过c-Fos免疫荧光染色确定LC神经元活性在抑郁伴疼痛小鼠中的改变;利用离体脑片电生理检测LC神经元兴奋性变化;通过化学遗传学技术调控LC活性,观察小鼠的疼痛及抑郁样行为表现。结果与对照组相比,CRS小鼠在束缚第3周（CRS 3W）出现明显的抑郁样行为,模型建立成功;CRS 3W小鼠机械痛阈显著下降,出现机械痛敏;CRS 3W小鼠LC区有大量c-Fos+表达,且90%为去甲肾上腺素（NE）能神经元;CRS 3W小鼠LC中NE能神经元兴奋性降低。而且,化学遗传学激活LC可显著缓解CRS 3W小鼠的机械痛敏。结论CRS 3W小鼠LC中NE能神经元兴奋性下降,化学遗传学激活LC中NE能神经元可缓解CRS 3W小鼠的机械痛敏。

关键词：蓝斑核化学遗传学慢性疼痛慢性束缚应激电生理新奇抑制进食强迫游泳

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

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安徽医科大学学报 2024年第2期59卷 193-199页

作者：陈露颖蒋励萍王伟康左书俊蒯佳婕马旸韩陈陈魏伟安徽医科大学临床药理研究所、抗炎免疫药物教育部重点实验室、抗炎免疫药物安徽省协同创新中心合肥230032

目的用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-sh... 详细信息

目的用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

关键词：类风湿关节炎 MH7A 肿瘤坏死因子受体相关因子2 慢病毒载体

小鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养方法及优化

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安徽医科大学学报 2024年第5期59卷 774-779页

作者：薛娜娜徐彩琪石勇荣张蕊孟浅安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省协同创新中心合肥230032

目的探究并优化新生小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法,为星形胶质细胞的体外培养提供更优解。方法为优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,取新生3 d的C57BL/6J小鼠大脑皮质组织,去除脑膜和血管,经胰酶消化后离心,加入高... 详细信息

目的探究并优化新生小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外原代培养方法,为星形胶质细胞的体外培养提供更优解。方法为优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,取新生3 d的C57BL/6J小鼠大脑皮质组织,去除脑膜和血管,经胰酶消化后离心,加入高糖的杜氏改良Eagle培养基(DMEM)吹打形成细胞悬液。进一步通过差速贴壁法、十字交叉手摇法以及恒温振摇法进行纯化,将细胞分别以不同培养密度接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,并通过形态学观察,免疫荧光染色等方法对星形胶质细胞进行纯度鉴定。结果新生小鼠大脑皮质细胞以5×10^(6)个/瓶密度接种效果好,活性高;纯化过程中使用高糖DMEM培养基联合差速贴壁法、十字交叉手摇法及恒温振摇法,星形胶质细胞纯度可达99%。结论成功建立并优化小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养方法。

关键词：星形胶质细胞大脑皮质原代培养细胞纯化胶质纤维酸性蛋白

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

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安徽医科大学学报 2024年第4期59卷 595-599页

作者：王卉卉朱向玲吴旭铭张慧茹周园园王安琪刘崇涂佳杰安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽协同创新中心合肥230032

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因... 详细信息

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。

关键词： Spi1 Cre/LoxP系统 CRISPR/Cas9技术 T细胞 PU.1 条件性敲除

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佐剂性关节炎大鼠肾功能损伤及对肾脏有机阴离子转运体3表达的影响

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安徽医科大学学报 2024年 1495-1500页

作者：李孟阳汪乾镭魏伟王春安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物安徽省协同创新中心安徽医科大学科研实验中心

目的研究佐剂性关节炎(AA)对大鼠肾脏功能和肾脏有机阴离子转运体3(OAT3)表达的影响。方法在大鼠右侧后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立AA模型。固定时间点收集大鼠血液和尿液,观察肾损伤指标的动态变化。通过肾脏的HE染色切片观察肾损... 详细信息

目的研究佐剂性关节炎(AA)对大鼠肾脏功能和肾脏有机阴离子转运体3(OAT3)表达的影响。方法在大鼠右侧后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立AA模型。固定时间点收集大鼠血液和尿液,观察肾损伤指标的动态变化。通过肾脏的HE染色切片观察肾损伤情况。免疫组化和Western blot检测肾皮质OAT3蛋白和炎性因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果与正常组相比,AA大鼠关节炎指数评分、继发性足爪肿胀、关节肿胀数、全身评分均显著增加(P免疫组化与Western blot结果显示,AA大鼠肾皮质OAT3的表达水平显著降低,同时炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平明显升高(P<0.05)。结论 AA大鼠的肾功能损伤可能与肾脏OAT3的表达降低及炎性因子表达升高有关。

关键词：佐剂性关节炎肾损伤大鼠肾皮质有机阴离子转运体3 炎性因子

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KAT7促进软骨细胞衰老

安徽医科大学学报 2024年第2期59卷 293-297页

作者：王旭蕾储柱平王惠敏魏伟严尚学安徽医科大学临床药理研究所抗炎免疫药物教育部重点实验室抗炎免疫药物协同创新中心合肥230032

目的建立过度复制诱导原代小鼠软骨细胞衰老模型及小鼠自然衰老模型,研究KAT7在软骨细胞及组织衰老中的作用。方法二型胶原酶消化法获取小鼠膝关节软骨细胞,使用甲苯胺蓝染色及ColⅡ染色鉴定小鼠软骨细胞;Western blot和细胞免疫荧光... 详细信息

目的建立过度复制诱导原代小鼠软骨细胞衰老模型及小鼠自然衰老模型,研究KAT7在软骨细胞及组织衰老中的作用。方法二型胶原酶消化法获取小鼠膝关节软骨细胞,使用甲苯胺蓝染色及ColⅡ染色鉴定小鼠软骨细胞;Western blot和细胞免疫荧光法检测不同代次小鼠软骨细胞衰老信号相关蛋白及KAT7表达水平,SA-β-Gal染色确定细胞衰老情况。取22月龄老龄小鼠与2月龄年轻小鼠关节HE染色、番红O-固绿染色比较小鼠关节病理情况;免疫组化观察小鼠关节组织中KAT7和p53的表达情况。结果与对照组相比,衰老的小鼠软骨细胞KAT7蛋白及p21、p53表达水平显著升高,KAT7抑制剂WM-3835可抑制衰老软骨细胞KAT7和p21的蛋白表达。SA-β-Gal染色可见,第八代(P8)较第一代(P1)软骨细胞阳染明显增加。与年轻小鼠软骨组织相比,老龄小鼠软骨组织呈现近骨性分布,软骨表面完整性降低,肥大软骨细胞数量显著增多,KAT7和p53细胞阳染增加。结论 KAT7在软骨细胞衰老模型及老龄小鼠软骨组织中表达升高,提示KAT7可能与软骨细胞衰老相关。

关键词： KAT7 衰老软骨细胞