采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

作     者：陈露颖 蒋励萍 王伟康 左书俊 蒯佳婕 马旸 韩陈陈 魏伟 Chen Luying;Jiang Liping;Wang Weikang;Zuo Shujun;Kuai Jiajie;Ma Yang;Han Chenchen;Wei Wei

作者机构：安徽医科大学临床药理研究所、抗炎免疫药物教育部重点实验室、抗炎免疫药物安徽省协同创新中心合肥230032 

出 版 物：《安徽医科大学学报》 (Acta Universitatis Medicinalis Anhui)

年 卷 期：2024年第59卷第2期

页      面：193-199页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(编号:82104187、82173824、81973332) 安徽省自然科学基金(编号:2108085QH382) 中国博士后科学基金(编号:2021T140002、2021M700184) 安徽省博士后基金(编号:2020B430) 

主　　题：类风湿关节炎 MH7A 肿瘤坏死因子受体相关因子2 慢病毒载体 

摘      要：目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。