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tat-functionalized Ag-Fe_3O_4 nano-composites as tissue-penetrating vehicles for tumor magnetic targeting and drug delivery

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2018年第6期8卷 956-968页

作者： Ergang Liu Meng Zhang Hui Cui Junbo Gong Yongzhuo Huang Jianxin Wang Yanna Cui Weibing Dong Lu Sun Huining He Victor C.Yang State Key Laboratory of Chemical Engineering School of Chemical Engineering and Technology Tianjin University Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnosis School of Pharmacy Tianjin Medical University Shanghai Institute of Materia Medica Chinese Academy of Sciences Department of Pharmaceutics School of Pharmacy Fudan University & Key Laboratory of Smart Drug Delivery Ministry of Education Department of Pharmaceutical Sciences College of Pharmacy University of Michigan

In this paper, we prepared a dual functional system based on dextrin-coated silver nanoparticles which were further attached with iron oxide nanoparticles and cell penetrating peptide(tat), producing tat-modified Ag-Fe_3O_4 nanocomposites(tat-FeAgNPs). To load drugs, an –SH containing linker, 3-mercaptopropanohydrazide, was designed and synthesized. It enabled the silver carriers to load and release doxorubicin(Dox) in a pH-sensitive pattern. The delivery efficiency of this system was assessed in vitro using MCF-7 cells, and in vivo using null BalB/c mice bearing MCF-7 xenograft tumors. Our results demonstrated that both tat and externally applied magnetic field could promote cellular uptake and consequently the cytotoxicity of doxorubicin-loaded nanoparticles,with the IC_(50) of tat-FeAgNP-Dox to be 0.63 mmol/L. The in vivo delivery efficiency of tat-FeAgNP carrying Cy5 to the mouse tumor was analyzed using the in vivo optical imaging tests, in which tatFeAgNP-Cy5 yielded the most efficient accumulation in the tumor(6.772.4% ID of tat-FeAgNPs).Anti-tumor assessment also demonstrated that tat-FeAgNP-Dox displayed the most significant tumor-inhibiting effects and reduced the specific growth rate of tumor by 29.6%(P ? 0.009), which could be attributed to its superior performance in tumor drug delivery in comparison with the control nanovehicles.

关键词： Cell penetrating peptide tat Silver nanoparticles Magnetic targeting Fe3O4 Hydrazone bond

细胞穿膜肽tat以非融合形式递送蛋白质的能力探究

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药学学报 2023年第8期58卷 2384-2390页

作者：窦佳吉丽娜华子春南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室江苏南京210023 江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所常州南京大学高新技术研究院江苏常州213164 南京吉芮康生物科技研究院江苏南京210044

穿膜肽tat被证实可用于不同类型药物分子的递送,包括核酸、蛋白质和小分子药物等。tat可以通过共价连接和非共价连接等形式递送分子。但是迄今tat采用非共价连接形式递送蛋白质分子的报道较少,也未有研究比较过融合形式和非融合形式下TA... 详细信息

穿膜肽tat被证实可用于不同类型药物分子的递送,包括核酸、蛋白质和小分子药物等。tat可以通过共价连接和非共价连接等形式递送分子。但是迄今tat采用非共价连接形式递送蛋白质分子的报道较少,也未有研究比较过融合形式和非融合形式下tat递送蛋白质能力的差异。为了探究非融合形式对于tat递送蛋白质能力的影响,本文采用了荧光显微镜观察和流式细胞检测法在细胞水平上探究了tat以非融合形式递送增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)进入人非小细胞肺癌细胞A549的能力,发现其可以穿膜递送EGFP,并且递送能力与tat浓度呈现正相关。同时,本文还表达纯化了tat与绿色荧光蛋白质EGFP的融合蛋白tat-EGFP并考察了其穿膜能力。本文将两种形式的递送效果进行定量对比后发现:当tat以融合蛋白形式递送EGFP时,其递送能力要明显优于tat以非融合形式递送EGFP的能力。本文报道了tat能够以非融合形式递送EGFP,尽管其递送效果有待进一步提高,但是该递送形式在操作便捷性上有着不可比拟的优势,是未来一种值得选择的递送方案。

关键词：细胞穿膜肽 tat 非融合表达递送形式 tat-EGFP 穿膜能力

Stability of HIV-1 subtype B and C tat is associated with variation in the carboxyl-terminal region

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Virologica Sinica 2016年第3期31卷 199-206页

作者： Xuechao Zhao Lingyu Qian Deyu Zhou Di Qi Chang Liu Xiaohong Kong Laboratory of Medical Molecular Virology School of MedicineNankai University

The multifunctional trans-activator tat is an essential regulatory protein for HIV-1 replication and is characterized by high sequence diversity. Numerous experimental studies have examined tat in HIV-1 subtype B, but research on subtype C tat is lacking, despite the high prevalence of infections caused by subtype C worldwide. We hypothesized that amino acid differences contribute to functional differences among tat proteins. In the present study, we found that subtype B NL4-3tat and subtype C isolate HIV1084 i tat exhibited differences in stability by overexpressing the fusion protein tat-Flag. In addition, 1084 i tat can activate LTR and NF-κB more efficiently than NL4-3 tat. In analyses of the activities of the truncated forms of tat, we found that the carboxylterminal region of tat regulates its stability and transactivity. According to our results, we speculated that the differences in stability between B-tat and C-tat result in differences in transactivation ability.

关键词： HIV-1 tat 稳定性 C亚型末端区域羧基转录活性 NF-κB

tat穿膜肽融合BoViperin蛋白的制备与抑制BPIV3/BoHV-1复制的评价

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TAT穿膜肽融合BoViperin蛋白的制备与抑制BPIV3/BoHV-1复制的评价

作者：底皓晴东北农业大学

学位级别：硕士

牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease BRD)是牛规模化养殖中常见疾病,发病急、死亡率高,严重威胁牛群健康,造成养牛业重大经济损失。引起该病的病原体有牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus Virus type 1,BoHV-1)、牛副流感病毒3型(B... 详细信息

牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease BRD)是牛规模化养殖中常见疾病,发病急、死亡率高,严重威胁牛群健康,造成养牛业重大经济损失。引起该病的病原体有牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus Virus type 1,BoHV-1)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)等,目前尚无有效的抗病毒药物进行治疗,因此研制安全、有效的抗病毒药物对于治疗该病具有重要意义。Viperin(virus inhibitory protein,endoplas mic reticulum-associated,interferon-inducible)是一种具有高效广谱的抗病毒效应、与内质网密切相关且受干扰素诱导的蛋白分子,可抑制多种病毒的复制。但目前未见Viperin抑制BPIV3和BoHV-1复制的相关报道。因此,本研究旨在探究在牛源细胞内过表达BoViperin对BPIV3和BoHV-1复制的影响,再利用人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,tat)穿膜肽介导BoViperin蛋白转导入牛源细胞和小鼠中,进一步探究BoViperin蛋白对BPIV3和BoHV-1复制的影响。本研究首先将真核表达载体pcDNA3.1-3HA-BoViperin转染至牛睾丸细胞(Bovine testicular cells BT)、牛肺成纤维细胞(Bovine lung cells,BL)。Western blot结果表明,转染36h时,BT细胞和BL细胞中BoViperin蛋白的表达量最高。在此基础上,用BPIV3和BoHV-1分别感染BT细胞、BL细胞,利用q PCR方法和病毒滴度测定法检测不同感染时间细胞样品中病毒的病毒载量和病毒滴度。试验结果表明,与对照组相比过表达的BoViperin能显著抑制BPIV3和BoHV-1的复制。其次,引入tat穿膜肽,构建原核表达质粒p ET-30a-tat-BoViperin、p ET-32a-tat-BoViperin和p GEX-6p-tat-BoViperin,转化至Rosetta感受态细胞中通过改变诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度。结果表明,p ET-30a-tat-BoViperin、p ET-32a-tat-BoViperin仅有少量tat-BoViperin蛋白的表达,p GEX-6p-tat-BoViperin成功表达tat-BoViperin蛋白,并用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化表达产物,将纯化后的tat-BoViperin蛋白中的内毒素进行去除。在细胞水平和动物水平上评价BoViperin蛋白的抗病毒活性,利用tat穿膜肽介导BoViperin蛋白通过跨膜转导进入牛源细胞和小鼠中。用CCK-8检测结果表明45μL/m L的tat-BoViperin蛋白对于MDBK细胞有较弱的增殖抑制和轻微的细胞毒性;4.5μL/m L及以上的tat-BoViperin蛋白对于BL细胞有一定的增殖抑制和细胞毒性。分别选取不同浓度的tat-BoViperin蛋白转导进入MDBK细胞、BL细胞后,用BPIV3和BoHV-1分别感染MDBK细胞和BL细胞,结果表明,tat-BoViperin蛋白在MDBK细胞、BL细胞上能显著抑制BPIV3/BoHV-1的复制,但tat-BoViperin蛋白只在细胞感染BoHV-1早期抑制BoHV-1的复制。将tat-BoViperin蛋白免疫C57 BL/6小鼠,免疫12h后用BPIV3人工感染小鼠,通过观察小鼠肺脏临床解剖变化、肺脏组织病理变化以及q PCR方法分析tat-BoViperin蛋白在小鼠中对BPIV3复制的影响。结果表明,tat-BoViperin蛋白在小鼠中可以抑制BPIV3的复制。综上所述,本研究证实在牛源细胞内过表达BoViperin可以抑制BPIV3和BoHV-1复制,利用p GEX-6p原核表达系统成功表达了tat-BoViperin蛋白;tat穿膜肽介导BoViperin蛋白可转导进入牛源细胞和小鼠肺中,阐明tat-BoViperin蛋白在细胞水平上可以抑制BPIV3和BoHV-1的复制,在感染鼠中可以抑制BPIV3的复制,表明在细胞水平和动物水平上BoViperin蛋白可迅速建立抗病毒感染状态。本研究证实,BoViperin蛋白具有开发为抗病毒药物的潜力,并且tat介导的可进入细胞的重组Viperin蛋白,具有制备简单、投递便捷等优势,可为开发高效、广谱牛抗病毒药物奠定基础。

关键词：牛副流感病毒3型牛疱疹病毒1型 BoViperin tat 抗病毒活性

Molecular dynamics simulation of site-directed mutagenesis of HIV-1 tat trans-activator

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Chinese Science Bulletin 1999年第8期44卷 708-711页

作者： Yan Cui Lunjiang Ling Runsheng Chen Longchuan Bai Jiangang Yuan Boqin Qiang Chinese Acad Sci Inst Biophys Beijing 100101 Peoples R China Chinese Acad Med Sci Inst Basic Med Sci Beijing 100005 Peoples R China

The Cys-rich domain, core region and basic domain are highly conserved and very important to the trans-activation activity of HIV-1 tat trans-activator. The three-dimensional structures of 6 mutants of HIV-1 tat protein were constructed with the methods of molecular dynamics simulation. The variations of the structures of the mutants have been analyzed and the factors that led to abolishment of trans-activation activity have been discussed.

关键词： human immunodeficiency virus type 1 ( HIV-1) molecular dynamics simulation site-directed mutagenesis tat protein.

tat、tPAIC、TM、PIC与儿童IgAV肾炎的相关性研究

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TAT、tPAIC、TM、PIC与儿童IgAV肾炎的相关性研究

作者：向舒蕾苏州大学

学位级别：硕士

目的:探讨凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(tPAIC)水平与儿童IgAV肾炎的相关性和各指标对儿童IgAV复发早期的预测价值。方法:本... 详细信息

目的:探讨凝血酶-抗凝血酶复合物(tat)、纤溶酶-α2纤溶酶抑制剂复合物(PIC)、血栓调节蛋白(TM)、组织纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(tPAIC)水平与儿童IgAV肾炎的相关性和各指标对儿童IgAV复发早期的预测价值。方法:本研究采集和回顾性分析了 2021年9月至2022年9月于苏州大学附属儿童医院就诊并住院治疗且与纳入标准相符的200例IgA血管炎患儿的年龄、性别、体重、既往史、家族史、临床表现;200例IgA血管炎患儿在病初完善的实验室检查:血常规、尿液常规、粪便常规、凝血常规、tat、tPAIC、TM、PIC、肾脏病理等临床病历资料。根据有无肾脏损害,将患儿分为IgAV无肾脏损害组(117例)及IgAV肾脏损害组(83例);根据是否复发,将患儿分为IgAV复发组(68例)及IgAV无复发组(132例),以上各组患儿在患病初期接受相同治疗方案。在相同时期收集200例同年龄段择期手术患儿的血常规、尿常规、粪常规、血沉、tat、tPAIC、TM、PIC、凝血常规等指标作为对照组。采用统计学软件进行分析,讨论tat、tPAIC、TM、PIC;凝血常规指标:D-Dimer、FIB、PT、TT、APTT;血常规相关指标:红细胞计数、血红蛋白含量、中性粒细胞计数、单核细胞计数、血小板计数等数据在不同器官损害中的表现。本研究通过二元Logistic回归分析各指标分别与儿童IgAVN、IgAV复发之间的关系。由绘制ROC曲线图分析各指标的最佳临界点及其在判断儿童IgAVN发生、IgAV复发时的预测价值。结果:1.共收集了200名IgA血管炎患儿,其中包括皮肤型(单纯皮肤型)50例(25.0%);腹型(皮疹合并胃肠道受累)22例(11.0%),关节型(皮疹合并关节受累)45例(22.5%);肾型(皮疹合并肾脏受累)48例(24.0%);混合型(皮疹合并其他系统两种或两种以上受累)35例(17.5%)。结果显示皮肤型占比最高。2.择期手术组与IgA血管炎患儿组间比较中,两组间患儿的tat、tPAIC、TM、PIC、FIB、D-Dimer、PLT、NEUT、MONO水平差异有统计学意义(Ptat、tPAIC、TM、PIC、PLT、FIB、D-Dimer、NEUT、MONO水平及皮疹复发次数、入院后皮疹持续时间等因素与IgAV无肾脏损害组患儿进行比较后发现,差异有统计学意义(Ptat的曲线下面积最大,是最佳预测因子。多项指标联合检测与单个指标相比曲线下面积更大。***复发及IgAV无复发两组在tat、tPAIC、TM、PIC、消化道出血、尿红细胞升高、静脉使用激素≥5天、口服激素≥2月、皮疹缓解时间≥6天、半年内尿常规异常次数≥2次等方面比较,差异有统计学意义(Ptat、tPAIC、尿红细胞升高、半年内尿常规异常次数≥2次是IgAV复发的独立危险因素,差异有统计学意义(Ptat、tPAIC为预测儿童IgAVN复发的潜在因子,其中tat是单个指标中的最佳预测因子。多项指标联合检测的曲线下面积较各单个指标曲线下面积最大。10.200个IgAV病例组患儿出院后第1个月出现28个IgAVN,出院后第3个月出现2个IgAVN,出院后第6个月出现7个IgAVN,IgAV患儿病程1个月内进展为IgAVN例数较多。TM、PIC、tPAIC水平升高组患儿IgAVN发生率分别为56.76%、62.16%、51.35%,差异有统计学意义(Ptat水平升高组患儿IgAVN发生率为45.95%(17/37),经统计学对比无显著差异(P>0.05)。结论:***患儿体内tat、tPAIC、TM、PIC水平均高于对照组,表明凝血、纤溶系统紊乱参与儿童IgAV的发生。***、tPAIC与儿童IgAVN的发生存在正相关。发生IgAVN的患儿tat、tPAIC、TM、PIC水平升高,提示凝血和纤溶异常也参与儿童IgAVN的发生过程。***、tat、tPAIC水平与儿童IgAV复发存在正相关,可作为复发预测因子。

关键词： IgAVN tat PIC TM tPAIC

Construction and identification of recombinant lentiviral vector containing HIV-1 tat gene and its expression in 293T cells

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The Journal of Biomedical Research 2010年第1期24卷 58-63页

作者： Bingbing Wei Ninghan Feng Feng Zhou Chun Lu Jiantang Su Lixin Hua Department of Urology the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University Nanjing 210029 China Department of Microbtology and Immunology Nanjing Medical University Nanjing 210029 China

Objective： To construct a lentiviral vector expressing HIV-1 tat and identify its expression in 293T cells. Methods： The gene fragment of HIV-1 tatlol was subcloned to lentiviral transfer vector pHAGE-CMV-MCS- IZsGreen, which was named pHAGE-tat. Then the constructed pHAGE-tat was used to co-transfect the packing 293T cells, together with the packaging plasmids pMD2.G and psPAX2. The packaged viral particles designated LV-tat were used to infect the 293T cells and the viral titer was calculated. The expression of HIV-1 tat in 293T cells was confirmed using RT-PCR and western blot. Results： The recombinant lentiviral vector was successfully constructed and could express HIV-1 tat in 293T cells. The virus titer was 5.73×10^6 ifu/ml. Conclusion： The successfully constructed recombinant lentiviral vector makes a strong foundation for further exploring the possible role of HIV-1 tat in the development of prostate cancer.

关键词： prostate cancer HIV-1 tat

N2O5/HNO3硝解tat制备HMX反应的理论研究

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N2O5/HNO3硝解TAT制备HMX反应的理论研究

作者：禤华广西大学

学位级别：硕士

提高含能材料1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四氮环辛烷(HMX)的产率和降低生产成本是过去几十年一直面临的问题。1,3,5,7-四乙酰基-1,3,5,7-四氮杂环辛烷(tat)法作为最有希望代替醋酐法合成HMX的方法之一,它具有反应温和、副产物少和产物回收... 详细信息

提高含能材料1,3,5,7-四硝基-1,3,5,7-四氮环辛烷(HMX)的产率和降低生产成本是过去几十年一直面临的问题。1,3,5,7-四乙酰基-1,3,5,7-四氮杂环辛烷(tat)法作为最有希望代替醋酐法合成HMX的方法之一,它具有反应温和、副产物少和产物回收率高等优点。但tat硝化难度大,且每一步硝化速率存在差异,对此现象缺乏充分的理论研究。采用密度泛函理论(DFT)研究了tat硝化合成HMX的机理,以期对实验上合成HMX提供一定的理论指导。本文利用DFT方法首先研究了NO/HNO在水溶剂环境中硝解tat制备HMX的反应机理。计算揭示了在NO硝化tat的第一步过程中存在两种不同的硝化方式,分别为硝化tat乙酰基氧原子和硝化tat环骨氮原子。前者更容易发生,但自发硝化tat乙酰基氧原子产物可与NO反应生成初始反应物tat。由于以上过程会消耗大量NO,所以它会影响tat环骨氮原子硝化反应发生。形成Step 1的主要产物后,其进一步硝化方向更倾向于对位而非邻位。最后阐明了环骨氮原子的硝化反应速率是由不稳定中间体的反应驱动力和稳定中间体发生正反应的能垒共同决定的。计算结果与实验结果吻合度较好。其次利用DFT方法研究了NO/HNO在离子溶液环境中硝解tat制备HMX的反应机理。在离子溶液环境中,每一步硝化环骨氮原子所形成的中间体都是稳定存在的,这意味着tat环骨氮原子的各步硝化反应速率与水溶液环境有所差别。计算结果表明离子溶液环境比水溶液环境更能促进硝化tat合成HMX的发生。离子溶液环境中决定硝化tat合成HMX反应速率的主要因素为稳定中间体发生正反应的能垒。最后,研究了三种不同阴离子在离子液体环境中对Step 1和Step 2的影响,计算结果证明了HSO最不利于这两步的顺利进行。

关键词：含能材料 tat HMX 密度泛函理论硝化反应反应机理

HIV-1 tat蛋白诱导神经认知损伤动物模型的建立及其损伤机理研究

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HIV-1 Tat蛋白诱导神经认知损伤动物模型的建立及其损伤机理研究

作者：谢婷雨武汉科技大学

学位级别：硕士

背景:虽然联合抗逆转录病毒疗法可以使HIV感染者体内的病毒被抑制,但是随着感染者生存期的延长,约50%的感染者会进一步发展成为HIV相关的神经认知功能障碍综合征(HIV-associated neurocognitive disorders,HAND)。近年来我国HAND患者数... 详细信息

背景:虽然联合抗逆转录病毒疗法可以使HIV感染者体内的病毒被抑制,但是随着感染者生存期的延长,约50%的感染者会进一步发展成为HIV相关的神经认知功能障碍综合征(HIV-associated neurocognitive disorders,HAND)。近年来我国HAND患者数量也在逐年增加,然而目前尚无理想的HAND动物模型来研究HAND的发生机制和有效的诊断、治疗方式。本研究将围绕HIV中可以直接或间接造成中枢神经系统损伤的tat蛋白,构建出HIV-tat蛋白诱导的神经认知损伤动物模型,并根据RNA-seq测序结果绘制ceRNA网络,预测tat蛋白在神经认知损伤中的作用机制,为研究HAND的发生机制及其有效的诊断、治疗以及药物开发提供依据。方法:将HIV-1 NL4-3和ADA毒株的tat基因分别插入到MLV载体的Env基因之前,构建出可表达HIV-tat蛋白的重组MLV病毒,并通过腹腔注射感染C57BL/6小鼠,建立tat蛋白诱导的神经认知损伤动物模型。再使用免疫荧光染色、高尔基染色、八臂迷宫和条件性恐惧测试和海马区长时程增强(Long-term Potentiation,LTP)检测验证小鼠模型的神经认知损伤程度。使用RNA-seq分析差异表达的非编码RNA,使用MiRanda和RNAhybrid数据库共同预测差异表达的miRNA可结合的circ RNA;miRDB和Targetscan数据库共同预测差异miRNA可能结合的mRNA基因,再通过GO和KEGG富集分析差异基因的功能与信号通路,最后构建出ceRNA网络进一步探索tat蛋白在小鼠体内的诱导神经认知损伤的机制。结果:本研究成功构建出可表达HIV NL4-3和ADA毒株tat蛋白的重组MLV病毒。行为学实验检测出MLV-tat组小鼠的工作记忆和恐惧记忆功能出现显著损伤。此外,小鼠的突触树突棘数量与结构也出现与tat蛋白相关的损伤。通过LTP检测发现神经认知损伤小鼠的海马区LTP变化幅度明显减弱,表明小鼠神经元突触可塑性受到损伤。以上结果均表明tat蛋白致神经认知损伤的小鼠模型成功建立。通过RNA-seq分析出神经损伤小鼠海马组织中差异表达的非编码RNA,使用MiRanda和RNAhybrid数据库共同预测共同差异表达的3个miRNA可结合的circ RNA,经过筛选后得到2个结合对:mmu＿circ＿0000042-mmu-miR-377-3p;mmu＿circ＿0002936-mmu-miR-206-3p。通过miRD和Targetscan数据库共同预测出mmu＿circ＿0000042和mmu＿circ＿0002936可能结合的6个mRNA基因。最后构建出ceRNA网络,使用GO和KEGG富集找到参与调节化学突触传递的基因Eif4e。发现mmu＿circ＿0002936可以通过与mmu-miR-206-3p结合,调节Eif4e影响化学突触的传递,最终参与tat蛋白诱导的神经认知损伤。结论:综上所述,本研究以MLV为载体成功构建出可表达HIV-1 tat蛋白的MLV-tat病毒,从而成功建立出HIV-1 tat蛋白诱导的神经认知损伤小鼠模型。通过RNA-seq分析出神经损伤小鼠海马组织中差异表达的非编码RNA,构建出ceRNA网络,并通过GO和KEGG富集找到参与调节化学突触传递的基因Eif4e。预测出tat蛋白诱导致神经损伤的作用途径为mmu-circ-0002936-mmu-miR-206-3p-Eif4e,此预测结果可为HAND的诊断、治疗以及药物开发提供理论据。

关键词： HIV-1 tat 神经认知损伤动物模型 HIV相关神经认知功能障碍全转录组测序