TAT穿膜肽融合BoViperin蛋白的制备与抑制BPIV3/BoHV-1复制的评价

作     者：底皓晴 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高明春;宋新刚

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛副流感病毒3型 牛疱疹病毒1型 BoViperin TAT 抗病毒活性 

摘      要：牛呼吸道疾病(Bovine respiratory disease BRD)是牛规模化养殖中常见疾病,发病急、死亡率高,严重威胁牛群健康,造成养牛业重大经济损失。引起该病的病原体有牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus Virus type 1,BoHV-1)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)等,目前尚无有效的抗病毒药物进行治疗,因此研制安全、有效的抗病毒药物对于治疗该病具有重要意义。Viperin(virus inhibitory protein,endoplas mic reticulum-associated,interferon-inducible)是一种具有高效广谱的抗病毒效应、与内质网密切相关且受干扰素诱导的蛋白分子,可抑制多种病毒的复制。但目前未见Viperin抑制BPIV3和BoHV-1复制的相关报道。因此,本研究旨在探究在牛源细胞内过表达BoViperin对BPIV3和BoHV-1复制的影响,再利用人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽介导BoViperin蛋白转导入牛源细胞和小鼠中,进一步探究BoViperin蛋白对BPIV3和BoHV-1复制的影响。本研究首先将真核表达载体pcDNA3.1-3HA-BoViperin转染至牛睾丸细胞(Bovine testicular cells BT)、牛肺成纤维细胞(Bovine lung cells,BL)。Western blot结果表明,转染36h时,BT细胞和BL细胞中BoViperin蛋白的表达量最高。在此基础上,用BPIV3和BoHV-1分别感染BT细胞、BL细胞,利用q PCR方法和病毒滴度测定法检测不同感染时间细胞样品中病毒的病毒载量和病毒滴度。试验结果表明,与对照组相比过表达的BoViperin能显著抑制BPIV3和BoHV-1的复制。其次,引入TAT穿膜肽,构建原核表达质粒p ET-30a-TAT-BoViperin、p ET-32a-TAT-BoViperin和p GEX-6p-TAT-BoViperin,转化至Rosetta感受态细胞中通过改变诱导时间、诱导温度以及IPTG浓度。结果表明,p ET-30a-TAT-BoViperin、p ET-32a-TAT-BoViperin仅有少量TAT-BoViperin蛋白的表达,p GEX-6p-TAT-BoViperin成功表达TAT-BoViperin蛋白,并用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化表达产物,将纯化后的TAT-BoViperin蛋白中的内毒素进行去除。在细胞水平和动物水平上评价BoViperin蛋白的抗病毒活性,利用TAT穿膜肽介导BoViperin蛋白通过跨膜转导进入牛源细胞和小鼠中。用CCK-8检测结果表明45μL/m L的TAT-BoViperin蛋白对于MDBK细胞有较弱的增殖抑制和轻微的细胞毒性;4.5μL/m L及以上的TAT-BoViperin蛋白对于BL细胞有一定的增殖抑制和细胞毒性。分别选取不同浓度的TAT-BoViperin蛋白转导进入MDBK细胞、BL细胞后,用BPIV3和BoHV-1分别感染MDBK细胞和BL细胞,结果表明,TAT-BoViperin蛋白在MDBK细胞、BL细胞上能显著抑制BPIV3/BoHV-1的复制,但TAT-BoViperin蛋白只在细胞感染BoHV-1早期抑制BoHV-1的复制。将TAT-BoViperin蛋白免疫C57 BL/6小鼠,免疫12h后用BPIV3人工感染小鼠,通过观察小鼠肺脏临床解剖变化、肺脏组织病理变化以及q PCR方法分析TAT-BoViperin蛋白在小鼠中对BPIV3复制的影响。结果表明,TAT-BoViperin蛋白在小鼠中可以抑制BPIV3的复制。综上所述,本研究证实在牛源细胞内过表达BoViperin可以抑制BPIV3和BoHV-1复制,利用p GEX-6p原核表达系统成功表达了TAT-BoViperin蛋白;TAT穿膜肽介导BoViperin蛋白可转导进入牛源细胞和小鼠肺中,阐明TAT-BoViperin蛋白在细胞水平上可以抑制BPIV3和BoHV-1的复制,在感染鼠中可以抑制BPIV3的复制,表明在细胞水平和动物水平上BoViperin蛋白可迅速建立抗病毒感染状态。本研究证实,BoViperin蛋白具有开发为抗病毒药物的潜力,并且TAT介导的可进入细胞的重组Viperin蛋白,具有制备简单、投递便捷等优势,可为开发高效、广谱牛抗病毒药物奠定基础。