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猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

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中国兽医学报 2022年第10期42卷 1994-2000页

作者：方剑玉白杰席燕燕黄慧敏徐引弟王改利张青娴徐彬李绍钰王克领河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002 畜禽繁育与营养调控河南省重点实验室河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽... 详细信息

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID_(50)猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID_(50)。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制PEDV复制的活性显著提高,为新型抗病毒药物开发提供了重要的依据和数据支持。

关键词：猪IFN-α14 抗病毒活性大肠杆菌表达猪流行性腹泻病毒

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羊干扰素α和γ融合表达及抗病毒活性分析

中国兽医学报 2023年第4期43卷 660-667页

作者：韩颖李秀丽豆子航郭笑然雷白时袁万哲赵款河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术工程技术创新中心河北保定071001

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果,根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列,使用Linker连接合成目的序列,成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制... 详细信息

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果,根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列,使用Linker连接合成目的序列,成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明,rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性,且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优;rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs)的mRNA转录水平,且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述,本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用,其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。

关键词：羊干扰素α和γ 细胞病变抑制融合表达抗病毒活性干扰素刺激基因

山羊α-干扰素基因克隆、原核表达及其抗病毒活性研究

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西北农业学报 2023年第8期32卷 1151-1158页

作者：徐菁昱刘艳芬陈绍红刘铀广东海洋大学滨海农业学院广东湛江524088 广东海洋大学食品科技学院广东湛江524088

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性,采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因,分析其核苷酸序列;采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,构建原核表达载体pET-mIFN-α,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱... 详细信息

为研究雷州山羊α-干扰素基因的遗传变异及重组α-干扰素的抗病毒活性,采用RT-PCR扩增雷州山羊α-干扰素基因,分析其核苷酸序列;采用PCR方法扩增山羊α-干扰素基因成熟肽编码序列,构建原核表达载体pET-mIFN-α,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达;采用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白rG-mIFN-α;通过细胞病变抑制法测定其抗小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GPV)活性。结果表明,雷州山羊α-干扰素全基因由570个核苷酸组成,编码189个氨基酸;与GenBank上发表的山羊、林麝、弯角大羚羊、黄牛、瘤牛、绵羊、猪、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为99.8%、95.6%、96.8%、94.7%、94.7%、96.8%、81.6%、77.8%和70.0%;氨基酸序列同源性分别为100%、92.6%、94.7%、92.1%、93.2%、93.7%、67.9%、61.6%和55.3%,提示反刍动物α-干扰素基因的核苷酸和氨基酸序列高度保守;rG-IFNα主要以包涵体形式存在,分子质量约32 ku;重组山羊α-干扰素能显著抑制PPRV和GPV感染引起的细胞病变,其抗PPRV和GPV效价分别为1.6×10^(4)U/mg和1.35×10^(4)U/mg。

关键词：雷州山羊 α-干扰素(IFN-α) 序列分析原核表达抗病毒活性

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 736-743页

作者：孙敏郝飞张纹纹李文良杨蕾蕾毛立程子龙刘茂军江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室南京210014 江苏大学生命科学学院镇江212013 江苏大学食品与生物工程学院镇江212013 南京农业大学动物医学院南京210095

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gI... 详细信息

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

关键词：山羊IFN-α 原核表达 ISGs 山羊副流感病毒3型抗病毒活性

大孔树脂纯化青蒿多酚的工艺设计及其体外抗病毒活性研究

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山东农业科学 2023年第9期55卷 173-180页

作者：王云雨王健张丽万新焕牛凤菊周长征山东中医药大学药学院山东济南250300 新疆医科大学第五附属医院药学部新疆乌鲁木齐830011

本试验比较了AB-8、NKA-9、HPD-100、DM130、D101及X-5六种大孔树脂对青蒿总多酚的纯化效果,筛选出富集青蒿多酚的最佳大孔树脂型号为HPD-100。采用单因素试验确定其最佳工艺参数:上样液pH值为2.0,质量浓度为50 mg/mL,上样量为13 BV,静... 详细信息

本试验比较了AB-8、NKA-9、HPD-100、DM130、D101及X-5六种大孔树脂对青蒿总多酚的纯化效果,筛选出富集青蒿多酚的最佳大孔树脂型号为HPD-100。采用单因素试验确定其最佳工艺参数:上样液pH值为2.0,质量浓度为50 mg/mL,上样量为13 BV,静态吸附2 h;洗脱液是体积分数为70%乙醇溶液,用量为5 BV。纯化后的青蒿总多酚纯度较纯化前增加了1.63倍。纯化后的青蒿总多酚对RSV、HSV-1和HSV-2均表现出显著的体外抗病毒活性,而对EV71未表现出较好的抑制效果。

关键词：大孔树脂青蒿多酚抗病毒活性

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重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

中国兽医学报 2023年第2期43卷 245-252页

作者：李秀丽韩颖赵款张武超梁飞杨欢雷白时袁万哲河北农业大学河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001 石家庄市动物基因工程药物技术创新中心河北石家庄050800 河北伯瑞动物药业有限公司河北正定050800 山东省莒南县动物疫病预防控制中心山东莒南276600

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪... 详细信息

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10^(6)IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。

关键词：重组猪干扰素α 大肠杆菌表达干扰素刺激基因细胞毒性抗病毒活性

重组猫IFN-α的质粒构建、真核表达及体外抗病毒活性分析

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中国动物传染病学报 2023年

作者：李沛恒邹万成陈竞张国庆崔春梅蒋嵘金宁一李昌中国农业科学院长春兽医研究所中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元吉林农业大学动物医学院

本文为探究猫IFN-α（FeIFN-α）在体外MDCK、F81细胞中的抗病毒效果，为后续体内实验提供参考。根据GenBank中登录的猫IFN-α（NP＿001027000.1）序列并添加6×His标签，合成后通过pUC57载体进行克隆，然后亚克隆至pcDNA3.1载体，获得... 详细信息

本文为探究猫IFN-α（FeIFN-α）在体外MDCK、F81细胞中的抗病毒效果，为后续体内实验提供参考。根据GenBank中登录的猫IFN-α（NP＿001027000.1）序列并添加6×His标签，合成后通过pUC57载体进行克隆，然后亚克隆至pcDNA3.1载体，获得含有目的基因的真核表达质粒，转染293T细胞，通过Western blot检测FeIFN-α的表达情况。通过重组绿色荧光蛋白水疱性口炎病毒（VSV-GFP）感染细胞实验，利用结晶紫染色法进行FeIFN-α抗病毒活性初步分析并确定最佳稀释倍数，通过荧光观察法、流式细胞术检测其抗病毒活性，最后通过相对荧光定量qPCR技术检测猫IFN-α对干扰素刺激基因（ISG15、MX1、OAS1）的调控作用。结果表明，成功表达FeIFN-α并具有生物学活性，且可以明显抑制VSV-GFP病毒侵染F81、MDCK细胞，qPCR结果分析表明猫IFN-α在F81、MDCK细胞中均可有效诱导ISG15、MX1、OAS1基因上调。上述实验为后续犬猫体内抗病毒实验提供参考依据。

关键词：猫IFN-α 构建与表达抗病毒活性干扰素刺激基因

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八仙草化学成分及其抗病毒活性

中成药 2023年第10期45卷 3290-3296页

作者：曾瑜黄海宁蒋莉唐炳兰陈路柳州市工人医院广西柳州545005 广西壮族自治区药用植物园西南濒危药材资源开发国家工程研究中心广西道地药材高品质形成与应用重点实验室广西南宁530023 广西壮族自治区人民医院广西南宁530021

目的研究八仙草Galium aparine L.的化学成分及其抗病毒活性。方法八仙草60%乙醇提取物采用D101大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、TLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT比色法对其抗病毒活性进行测定... 详细信息

目的研究八仙草Galium aparine L.的化学成分及其抗病毒活性。方法八仙草60%乙醇提取物采用D101大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、TLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT比色法对其抗病毒活性进行测定。结果从中分离得到17个化合物,分别鉴定为槲皮素(1)、山柰酚(2)、芦丁(3)、异鼠李素(4)、香叶木素(5)、表没食子儿茶素(6)、表儿茶素没食子酸酯(7)、异牡荆素-2″-O-α-L-鼠李糖苷(8)、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(9)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(10)、异鼠李素-3-O-芸香糖苷(11)、异鼠李素-3-O-芸香糖-7-O-β-D-葡萄糖苷(12)、β-谷甾醇(13)、β-胡萝卜苷(14)、丁香酸(15)、3,4-二羟基苯甲酸(16)、车叶草苷(17)。化合物7抗H5N1病毒半数有效浓度为(0.06±0.01)mmol/L。结论化合物12为首次从拉拉藤属植物中分离得到,化合物4~11、15~16为首次从该植物中分离得到。化合物7具有较强的抗H5N1病毒活性。

关键词：八仙草化学成分分离鉴定抗病毒活性 H5N1

朱砂七化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性研究

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中成药 2023年第5期45卷 1537-1543页

作者：王冯瑞王薇刘辰旺但林蔚李玉泽姜祎张化为张东东宋小妹陕西中医药大学药学院陕西咸阳712046

目的研究朱砂七Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性。方法朱砂七75%乙醇提取物采用硅胶柱层析、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构... 详细信息

目的研究朱砂七Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi化学成分及其体外细胞毒性、抗病毒活性。方法朱砂七75%乙醇提取物采用硅胶柱层析、半制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用MTT法测定体外细胞毒活性,CCK-8法测定体外抗病毒活性。结果从中分离得到20个化合物,分别鉴定为3-acetyl-4,5-dimethoxy-benzoic acid(1)、没食子酸甲酯(2)、没食子酸(3)、对羟基苯甲醛(4)、原儿茶酸(5)、3,4-二羟基苯甲醛(6)、丁香酸(7)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(8)、p-hydroxyphenethyl-O-β-D-glucoside(9)、2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-ethyl-O-β-D-glucoside(10)、反式-白藜芦醇(11)、顺式-白藜芦醇(12)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-反式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(13)、白藜芦醇-3-O-β-D-(2′-O-顺式-肉桂酰基)-葡萄糖苷(14)、白藜芦醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(15)、N-反式阿魏酰-3-甲氧基酪胺(16)、poke-weed cerebroside(17)、何首乌乙素(18)、9,10,13-三羟基十八烷酸(19)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(20)。化合物11对HCT116、SW620细胞的IC 50值分别为(30.87±2.7)、(56.11±0.49)μmol/L,化合物12对EV-A71病毒的抑制率为50.21%。结论化合物1为新天然产物,化合物9~10为首次从蓼科植物中分离得到,化合物8、12、14、17、19为首次从何首乌属植物中分离得到,化合物2、4~7、11、18为首次从该植物中分离得到。化合物11具有细胞毒性,化合物12具有抗病毒活性。

关键词：朱砂七化学成分分离鉴定细胞毒性抗病毒活性