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GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与p38MApK相关性的研究

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GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达及其与P38MAPK相关性的研究

作者：徐曼中国医科大学

学位级别：硕士

前言GSK3β是糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase, GSK-3)的亚型之一。近年来越来越多的研究证实,GSK3β不仅仅参与糖原代谢过程,它更是一个多功能激酶,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要... 详细信息

前言GSK3β是糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase, GSK-3)的亚型之一。近年来越来越多的研究证实,GSK3β不仅仅参与糖原代谢过程,它更是一个多功能激酶,在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化、细胞运动以及肿瘤发生等方面都扮演了重要角色。近来研究发现,GSK3β在乳腺癌的发生发展过程中起到了重要作用,并参与了乳腺癌细胞生长和细胞凋亡信号通路调控。但是,GSK3β是否参与了乳腺癌细胞的转移仍然是个有待于研究的问题。p38MApK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MApK)家族的重要成员。最近,p38MApK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。为此,本研究检测了p-p38, p-GSK3βser9, GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达情况,并进一步研究GSK3β在乳腺癌侵袭中的作用以及GSK3β和p38MApK通路的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法1、材料(1)细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s,原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。(2)主要试剂鼠抗人p-p38抗体购自Cell signaling公司。兔抗人GSK3β抗体购自Bioworld公司。兔抗人p-GSK3pser9抗体购自Santa公司。p38MApK特异性抑制剂SB203580购自美国Calbiochem公司。GSK3p特异性抑制剂SB216763购自Cayman公司。Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。2、方法(1) Western印迹法收集细胞加入RIpA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-pAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗。ECL发光,观察拍照,进行灰度值测定。(2)免疫荧光染色取对数生长细胞接种到孔板中。固定、TritonX-100处理、封闭后加相应一抗、二抗,复染细胞核,荧光显微镜观察拍照。(3) Transwell实验Transwell小室接种细胞后培养,擦去上室内细胞后固定,染色,观察拍照,进行细胞计数。3、统计学分析应用SpSS13.0统计软件行数据处理：采用t检验分析Western Blot图像灰度值、Transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,pp-p38、p-GSK3βser9, GSK3β在乳腺癌细胞系中的表达(1)Western印迹法检测,在三种乳腺癌细胞系MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435s中,p-GSK3βser9和p-p38的表达呈递增趋势,GSK3β表达无明显差别。(2)选取p-p38, p-GSK3βser9均高表达的高侵袭高转移细胞系MDA-MB-435s,免疫荧光定位显示：p-p38在MDA-MB-435s中主要表达在细胞核,细胞浆中仅有微弱的表达;而p-GSK3pser9在MDA-MB-435s中主要表达在细胞浆,细胞核中仅有微弱的表达。2、GSK3β抑制剂LiCL和SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-GSK3βser9和GSK3β变化(1) Western印迹法检测显示：LiCL和SB216763均可上调p-GSK3βser9表达水平,GSK3p无明显变化。(2)免疫荧光定位显示：SB216763作用MDA-MB-435s细胞系24h后p-GSK3βser9胞浆表达减少,核表达增多。(3)Transwell实验显示：SB216763能浓度依赖性地增加乳腺癌细胞MDA-MB-435s的侵袭转移潜能。3、p38MApK抑制剂SB203580对GSK3β活性的影响Western印迹法检测显示,SB203580浓度性依赖性的地下调MDA-MB-435s中p-p38, p-GSK3βser9蛋白的表达,但不影响GSK3β蛋白的表达。讨论GSK3β是一个多功能的蛋白激酶,它在蛋白合成、细胞增殖、细胞分化和细胞运动等方面发挥重要作用。GSK3β的活性主要通过3种不同方式共同调节：(1)不同位点的磷酸化状态调节GSK3β活性。在N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化可降低GSK3β活性,而在酪氨酸216(Tyr216)处磷酸化则可增强它的活性;(2)细胞内定位调控G

关键词： p-p38 p-GSK3βser9 GSK3β 乳腺癌转移

GSK3β和p38MApK在乳腺癌组织中的表达及意义

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GSK3β和p38MAPK在乳腺癌组织中的表达及意义

作者：安淑香中国医科大学

学位级别：硕士

前言糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3,GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节细胞增殖与凋亡,微管动力学及细胞运动和血管生成。致瘤转录因子和癌蛋白作为GSK3p底物,由GSK3β磷酸化失活,抑制GSK3β的活性及表达诱导EMT,表... 详细信息

前言糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3,GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节细胞增殖与凋亡,微管动力学及细胞运动和血管生成。致瘤转录因子和癌蛋白作为GSK3p底物,由GSK3β磷酸化失活,抑制GSK3β的活性及表达诱导EMT,表明GSK3p在肿瘤发生和侵袭转移中发挥作用。p38MApK是Mitogen Activated protein Kinase(MApK)家族的重要成员在细胞运动、肿瘤侵袭转移方面具有重要的调控功能。GSK3p位点的磷酸化状态调节GSK3β的活性,在N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化可降低GSK3p活性。GSK3β与p38MApK存在一定关系,新近研究发现在鼠F9畸胎癌细胞,p38MApK可以通过使GSK3β的N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化失活调节经典的Wnt信号通路。在胸腺和脑组织中p38MApK可以通过直接磷酸化GSK3p的C端使其灭活,而且这一行为能导致***的聚集,这些表明GSK3β可能受p38MApK的调控。有关GSK3β在乳腺癌体外的研究较多,抑制GSK3p的活性抑制乳腺癌细胞凋亡,促进Wnt信号通路的活化,提示GSK3β的失活促进细胞的恶性转化和肿瘤发展,但关于它在乳腺癌组织中的表达研究鲜见报道,p38MApK可能磷酸化GSK3β促进其失活。本文研究p-GSK3β,p-p38和总的GSK3β在乳腺癌组织中的表达及和临床病理因素的关系,明确GSK3β在乳腺癌组织中表达的意义。材料和方法1、材料(1)临床资料80例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科,为2005年-2008年手术切除标本。依据WH02003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类,80例均为浸润性导管癌。收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为乳腺浸润性导管癌,20例为乳腺纤维腺瘤。(2)主要试剂兔抗人p-GSK3β-ser9多克隆抗体(sc-11757-R)购自Santa Cruz公司,鼠抗人p-p38单克隆抗体(#9216)购自Cell Signaling公司,兔抗人GSK3β(BS1402)多克隆抗体购自Bioworld Technology公司。S-p超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。2、方法(1)免疫组织化学(S-p)法采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(S-p法)。pBS代替一抗作为阴性对照,用已知阳性片作阳性对照。(2) Western Blot取新鲜样品(约3mm3)加裂解液,剪碎,匀浆超声处理,高速低温离心提取上清蛋白,电泳,转印,经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。图像扫描,测定p-GSK3β、p-p38蛋白的灰度值。3、统计学分析采用SpSS for windows11.5统计学软件,进行χ2检验、t检验和pearson相关分析。pp-GSK3β、p-p38和GSK3β蛋白在乳腺癌组织中的表达及其同临床病理因素的关系(1)免疫组织化学结果显示,p-GSK3β蛋白主要位于乳腺癌细胞浆,呈棕黄色颗粒,阳性率为67.5%(54/80)。p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内,呈棕黄色颗粒,阳性率为60.0%(48/80)。p-GSK3β和p-p38蛋白表达与乳腺癌临床分期和淋巴结转移有关,与患者年龄和肿瘤大小没有关系,p-GSK3β蛋白与组织学分级有关(0.019)。56%的乳腺癌组织中GSK3β蛋白胞质表达消失,32.5%乳腺癌组织发现GSK3β蛋白核表达,胞核表达的GSK3β蛋白和乳腺癌的临床分期及ER表达有关。(2)Western Blot结果表明p-GSK3β和p-p38两种蛋白含量在乳腺癌组织与纤维腺瘤中的差异具有明显的统计学意义。2、乳腺癌组织中p-p38和p-GSK3β蛋白表达相关性分析p-p38表达阳性的48例乳腺癌组织中p-GSK3β表达阳性者36例;p-p38表达阴性的32例乳腺癌组织中p-GSK3β表达阴性者14例。统计学分析显示p-p38和p-GSK3β两者之间表达存在正相关(r=0.316,p<0.05)。讨论GSK3β抑制Wnt通路,调节细胞增殖和凋亡,在肿瘤的发生中发挥重要作用,体外研究表明在乳腺癌细胞系激活GSK3β促进细胞凋亡。Marganit Farago等通过基因修饰的方式抑制乳腺癌细胞系中GSK3β的活性,发现Wnt通路异常激活,促进乳腺肿瘤的发生。抑制GSK3β

关键词： p-p38 p-GSK3β GSK3β 乳腺癌

p-ezrin通过p38MApK信号通路介导乳腺癌转移

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P-ezrin通过p38MAPK信号通路介导乳腺癌转移

作者：卢一艳中国医科大学

学位级别：硕士

前言埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin,ERM)蛋白家族通过组成膜细胞骨架相关复合体和特殊膜结构对细胞活动进行调节,在肿瘤的侵袭转移中起了重要的作用。细胞骨架连接蛋白ezrin属于ERM家族成员之一,定位于6q25.2-6q26编... 详细信息

前言埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin-Radixin-Moesin,ERM)蛋白家族通过组成膜细胞骨架相关复合体和特殊膜结构对细胞活动进行调节,在肿瘤的侵袭转移中起了重要的作用。细胞骨架连接蛋白ezrin属于ERM家族成员之一,定位于6q25.2-6q26编码基因为villin2。新近研究发现ezrin高表达与多种恶性肿瘤的侵袭转移呈正相关。细胞内ezrin通过N端与C端相互作用,形成头尾连接的折叠状态遮蔽了分子表面的结合位点,处于失活状态。Fievet等发现Thr567磷酸化和pIp2共同参与ezrin活化,活化的ezrin通过连接F-肌动蛋白丝与胞膜的CD44,E-钙黏附蛋白(E-cadherin),细胞间黏附分子1/2(Intercellular adhesion molecule1/2,ICAM1/2)等发挥功能。探讨ezrin上下游调控分子,这些与调控有关的分子将会成为治疗肿瘤转移的关键。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated protein Kinase,MApK)是细胞的主要信号传导系统之一,p38MApK属于MApK的一个亚族,它通过磷酸化作用改变下游因子的表达,参与多种胞内信息传递过程。多种生长因子、炎症因子和应激反应可激活p38MApK,p38MApK激活后可使多种转录因子活化,影响基因转录、蛋白合成,细胞能动性和细胞骨架结构改变,在细胞侵袭、转移方面具有重要的调控功能。综上p38和ezrin只有都磷酸化后才能行使后续功能,目前关于p-p38,p-ezrin两者在介导乳腺癌转移方面的研究,国内外鲜有报道。 Mengdong Lan等研究发现小鼠永生性肝细胞系中ezrin蛋白通p38MApK信号通路的磷酸化参与微绒毛的形成,这说明p38与ezrin可能存在着一定的联系,但是作者认为:1:转染raf-1基因的小鼠肝细胞中snail表达上调E-caherin,ezrin表达下调,微绒毛缩短,小鼠肝细胞发生上皮间质转,细胞间黏附变弱而易发生转移。2:加入p38抑制剂SB203580后,ezrin,p-ezrin,E-cadherin表达上调,微绒毛变长变粗,而snail表达下调,不易发生转移。然而我们认为:p38MApK信号通路可能参与ezrin C端(Thr567)的磷酸化,使p-ezrin上调,微绒毛变长变粗,从而增强肿瘤的侵袭转移能力。为此本实验在回顾乳腺癌中p-ezrin和p-p38表达的基础上,着重研究两者在乳腺癌细胞系中的关系。探讨p38MApK通路是否参与ezrin C端(Thr567)的磷酸化,影响p-ezrin蛋白表达,微绒毛的形成。为乳腺癌复发转移的治疗提供新的理论依据。材料和方法 1、材料 (1)临床资料80例乳腺癌组织,取自于中国医科大学附属第一医院2001年1月至2007年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。80例均为乳腺浸润性导管癌(IDC),TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例,Ⅲ-Ⅳ期29例。有淋巴结转移33例;收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为IDC,有淋巴结转移为13例,20例为乳腺纤维腺瘤。 (2)细胞系三种人乳腺细胞系(MCF-10A为乳腺正常上皮细胞系,MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系,MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系)原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。 (3)主要试剂抗人p-p38单克隆抗体(#9216)和兔抗人p-ezrin单克隆抗体(#3149)购自Cell signaling公司。p38MApK特异性抑制剂SB203580(#559398)购自美国Calbiochem公司,于-20℃保存待用。异硫氰四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)购自Sigma公司,Transwell小室(孔径8um)购自Corning公司。 2、方法 (1)免疫组织化学技术80例标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(Streptavidin-peroxidase,S-p)按说明书行免疫组化染色。p-p38稀释比例为1∶200,p-ezrin稀释比例为1∶50;以pBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。 (2)Western blot技术总蛋白从组织、生长到对数期收集的细胞及不同浓度的SB203580(0、5、10、20umol/L)处理24小时后的435s细胞中提取。用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白,进行SDS-pAGE和转印,分别孵育一抗(p-p38 1∶400,p-ezrin1∶400稀释)4℃过夜,相应二抗(1∶4000)37℃孵育,ECL发光,

关键词： p-p38 p-ezrin 乳腺癌转移

HSp90抑制剂对白念珠菌刺激巨噬细胞增殖和p38MApK表达的影响

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HSP90抑制剂对白念珠菌刺激巨噬细胞增殖和p38MAPK表达的影响

作者：霍文倩河北医科大学

学位级别：硕士

目的:炎症反应是宿主抵抗病原体的一个重要反应途径,然而,当炎症过度活化或失去调节时,将导致宿主的组织损伤。大量实验证实:过度活化的炎性细胞因子介导的固有免疫和适应性免疫能够导致人类脓毒血症以及免疫功能障碍的发生。在临床中,... 详细信息

目的:炎症反应是宿主抵抗病原体的一个重要反应途径,然而,当炎症过度活化或失去调节时,将导致宿主的组织损伤。大量实验证实:过度活化的炎性细胞因子介导的固有免疫和适应性免疫能够导致人类脓毒血症以及免疫功能障碍的发生。在临床中,念珠菌血症具有一些同细菌性脓毒血症相似的症状。早期大部分表现为中高热、低血压、心率增快以及酸中毒等症状,而晚期一些患者常发展为感染性休克以及多器官功能障碍。促分裂原活化蛋白激酶（MApK）家族在炎症和应激中是信号转导重要的组成部分,能够调控一系列的生理过程。MApK家族包括p38,JNK,和ERK,并通过磷酸化激活。有研究显示,在细菌性脓毒血症中p-p38,p-ERK,p-JNK的表达显著增加,而MApK的磷酸化可导致器官的损伤。此外,p38的激活能够调节巨噬细胞和T细胞对创伤性损伤的反应。热休克蛋白是一组分子伴侣蛋白,当细胞遭受高温或者其他外界刺激时,能够维持客户蛋白的稳定性,防止未折叠蛋白降解。HSp90做为重要的分子伴侣之一,负责客户蛋白的三级折叠,如IKK,IRAK-1和MAp激酶,并通过TLR信号途径参与固有免疫反应。在体外实验中,HSp90抑制剂能够减轻脂多糖（LpS）诱导的大鼠脓毒血症中的炎症反应,延长大鼠的生存期。在LpS体外刺激小鼠巨噬细胞的实验中,HSp90抑制剂能够通过降低p38的磷酸化水平以及介导巨噬细胞的凋亡而发挥抗炎作用。而HSp90抑制剂对由白念珠菌引起的炎症反应未见报道。本实验通过白念珠菌体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞,探讨HSp90抑制剂是否通过抑制巨噬细胞的增殖及降低p38磷酸化水平而发挥抗炎作用。方法:1实验用小鼠健康的雌性昆明种小鼠35只,清洁级,4-5周龄,18～23g,由河北医科大学实验动物中心提供,合格证编号:1508052。2实验用菌株白念珠菌标准株atcc90028购于中国医学科学院微生物研究所。3菌株的活化、菌悬液的配制及灭活白念珠菌标准株复温后在沙氏培养基上传代三次,加入含0.1%吐温80的1640培养液,吸管轻轻吹打混匀,血球计数板计数,调整终浓度为1-2×106/ml。随后将装有白念珠菌的试管放入65℃水浴锅中加热30min进行灭活。4巨噬细胞分离培养及鉴定采用小鼠腹腔巨噬细胞分离法提取巨噬细胞,1640培养液（含10%胎牛血清）进行培养,巨噬细胞培养3天后取出。采用形态学及免疫组织化学法进行巨噬细胞的鉴定:将巨噬细胞制成单细胞悬液后,进行细胞爬片,第2天后,取出盖玻片,丙酮固定,进行he染色及免疫组织化学sp法检测巨噬细胞cd68抗原的表达,中性树胶封固。5实验分组与处理实验分为实验组和对照组。巨噬细胞培养3天后取出,离心洗涤后计数板计数。并用含10%胎牛血清1640培养液调整终浓度至5-6×105/ml,转种至6孔板中,每孔2ml,培养8-10小时后每孔加入浓度为2×106/ml菌悬液0.5ml。实验组每孔分别加入终浓度为0.01μmol/lμmol/l的17-dmag100μl,对照组则加入同体积含10%胎牛血清1640培养液。于第12小时分别收集实验组及对照组细胞,-80℃冻存待测。每组均设置4个重复孔。6westernblot法检测各组细胞磷酸化p38蛋白的表达水平实验各组巨噬细胞从六孔板吹打下来后离心,pbs洗涤2遍,用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液ripa将上述细胞裂解,提取总蛋白,采用sds-page凝胶电泳,随后转至pvdf膜,牛奶蛋白封闭后,分别孵育p-p38（1:300）与β-actin（1:1000）一抗及抗兔igg二抗（1:3000）,最后用双色红外激光扫描仪进行扫膜,imagej软件分析结果。7cck-8法检测各组细胞增殖率的变化将100μl浓度为5-6×105/ml的细胞悬液接种至96孔培养板内,放置细胞培养箱8h后,分别加入90μl浓度为5.5-6.5×105/ml菌悬液及10μl终浓度为0.01μmol/l、0.1μmol/l、0.5μmol/l、1μmol/l的hsp90抑制剂孵育12h。同时设对照组（不加药物组）和空白组（只加培养液和白念珠菌悬液）,孵育12h后,每孔加入20μl的cck-8溶液,继续放置细胞培养箱内,3h后用酶标仪测定各孔在450nm波长的a值。按照公式:增殖抑制率（pi）=[a（对照组）-a（实验组）]/[a（对照组）-a（空白组）]×100%。计算细胞增殖抑制率。每组均设置3个重复孔。8巨噬细胞增殖与p-p38表达的相关分析用spearman相关分析法将上述计算的细胞增殖抑制率与p-p38的表达水平进行相关分析9统计学分析用spss13.0统计软件,数据结果以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用s-n-k检验,p<0.05为有统计学意义。结果1巨噬细胞形态观察培养第1天后,倒置

关键词： HSp90抑制剂 17-DMAG 白念珠菌巨噬细胞 p-p38

BMp-2通过p38MApK信号通路抑制VEGF表达的研究

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BMP-2通过p38MAPK信号通路抑制VEGF表达的研究

作者：姚晓慧中国医科大学

学位级别：硕士

目的乳腺癌是女性最普遍的恶性肿瘤之一,在发达国家,它位于所有死亡原因的第二位。与前列腺癌相似,乳腺癌也有易发生骨转移的倾向。有研究表明,骨形成蛋白(BMp)在骨肿瘤的发病和转移中起重要作用,其中BMp-2作用尤其明显。肿瘤新生血管... 详细信息

目的乳腺癌是女性最普遍的恶性肿瘤之一,在发达国家,它位于所有死亡原因的第二位。与前列腺癌相似,乳腺癌也有易发生骨转移的倾向。有研究表明,骨形成蛋白(BMp)在骨肿瘤的发病和转移中起重要作用,其中BMp-2作用尤其明显。肿瘤新生血管的形成是肿瘤发生侵袭和转移的重要因素,许多血管生长因子在肿瘤中均有不同程度的表达。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)是其中效力最强的因子之一,它可直接或间接地参与血管新生的每一个过程。p38MApK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,,MApK)家族的重要成员,p38MApK信号通路因以正性调节的方式参与肿瘤的侵袭转移过程而倍受关注。有研究表明,BMp-2可能在VEGF介导的血管生成机制中起重要作用,也有人报道p38MApK信号传导通路可能调节VEGF上调。因此,本研究检测了p-p38,BMp-2及VEGF在乳腺癌组织中的表达情况,并进一步在体外研究p38MApK通路与BMp-2的关系,为乳腺癌治疗提供相应的理论依据。材料与方法 1、材料 68例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科,为2003年～2006年手术切除标本。依据WHO2003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类,68例均为浸润性导管癌。人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s、MCF-7及人正常乳腺细胞系10A购自中国协和医科大学细胞库。 2、主要试剂兔抗人BMp-2单克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人p-p38单克驴固?#9216)购自Cell Signaling公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(IE-0031)、羊抗鼠(IE-0141)二抗、兔抗人β-actin多克隆抗体(pR-0255)、S-p超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、p-p38特异性抑制剂SB203580、BMp-2特异性抑制剂Nogin、Matrigel胶均自北京中山生物技术有限公司。 3、方法 (1)免疫组织化学步骤:(采用Sp法)以pBS代替一抗设立空白对照,以已知乳腺癌阳性片作为阳性对照。结果判定:在双盲法下进行,BMp-2、VEGF以肿瘤细胞胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达,p-p38以肿瘤细胞胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片在光镜下随机选取5个视野,每个视野计数100个瘤细胞。着色强度分为无色(-)为0分,浅黄色(+)为1分,黄色及棕黄色(++)为2分。阳性细胞数分为＜10%为0分,10%-50%为1分,＞50%为2分。两项得分相乘结果≥2记为阳性。 (2)Western印迹法:RIpA buffer裂解液,超声处理,高速低温离心提取总蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度测定。SDS-pAGE电泳,转印,封闭后加相应一抗、二抗及DAB显色,观察拍照,进行灰度值测定。 (3)Transwel法:步骤:用无血清1640以1:3稀释Matrigel,每上室加入Matrigel100微升,37度孵箱中放置了24小时。胰酶消化细胞,细胞计数后稀释至2.5×10cells/ml,取100微升加入上室中,下室加入600微升10%FBS 1640。5%CO37度中培养24小时。固定及染色,切片制作,显微镜下照相并进行细胞计数。 4、统计学分析采用SpSS10.0统计学软件,进行x检验和t检验,确定p＜0.05有统计学意义。结果 1、BMp-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移的关系应用免疫组织化学染色显示,BMp-2蛋白主要分布于乳腺癌细胞的胞浆内;VEGF蛋白主要分布于乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞的胞浆内,乳腺癌细胞浓染,正常乳腺细胞淡染;p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内,呈棕黄色颗粒。31例有淋巴结转移的乳腺癌患者中23例BMp-2表达阳性,阳性率为74.2%,37例无淋巴结转移的患者15例表达阳性,阳性率为40.5%,差异有显著性(p＜0.01)。VEGF在有淋巴结转移的患者中阳性率为67.7%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为35.1%,差异有显著性(p＜0.05)。p-p38在有淋巴结转移的患者中阳性率为61.3%,在无淋巴结转移的患者中阳性表达率为37.8%,差异有显著性(p＜0.05)。 2、BMp-2、p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达 Western Blot结果显示BMp-2、p-p38、VEGF在高转移细胞系MDA-MB-435s中的表达高于低转移细胞系MCF-7中的表达高于正常乳腺细胞的表达(p＜0.05)。 3、加入BMp-2特异性抑制剂Noggin后p-p38、VEGF蛋白在乳腺癌细胞系中的表达 Western Blot结果显示加入BM

关键词：乳腺癌 BMp-2 p-p38 VEGF 淋巴结转移

天麻素对老年痴呆动物模型的抗氧化作用及其机制

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解剖学报 2010年第4期41卷 485-490页

作者：傅希玥李守民王婷婷李兴国孙俊陆地昆明医学院人体解剖学教研室昆明650032 昆明医学院附属第一医院神经内科昆明650031

目的构建β-淀粉样肽(1-40)(Aβ1-40)联合D-半乳糖(D-gal)致痴呆模型,探讨天麻素抗氧化的分子机制。方法成年雄性SD大鼠36只,侧脑室注射Aβ1-40联合腹腔注射D-gal构建SD大鼠痴呆模型,并同时给予天麻素预防性治疗,采用Morris水迷宫实验(M... 详细信息

目的构建β-淀粉样肽(1-40)(Aβ1-40)联合D-半乳糖(D-gal)致痴呆模型,探讨天麻素抗氧化的分子机制。方法成年雄性SD大鼠36只,侧脑室注射Aβ1-40联合腹腔注射D-gal构建SD大鼠痴呆模型,并同时给予天麻素预防性治疗,采用Morris水迷宫实验(MWM)进行行为学检测,用化学比色法检测大脑皮质过氧化氢(H2O2)及还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽还原酶(GR)的含量。用免疫印迹法检测大脑皮质中p38和p-p38的含量。结果痴呆模型组与对照组比较:逃避潜伏期明显延长(ppppp-p38表达增加(pppppp-p38表达减少(pp38的表达在3组之间无差异(p>0.05)。结论天麻素影响了痴呆模型大鼠皮质部分内源性巯醇抗氧化物(酶)如GSH和GR的含量,抑制了H2O2的产生,影响了p-p38的表达,对改善学习记忆能力,对抗大鼠神经系统的退行性变有一定的作用。

关键词：天麻素 β-淀粉样肽(1-40) D-半乳糖 p-p38 Morris水迷宫巯醇抗氧化物(酶) 免疫印迹法大鼠

黄芩素对BCRp介导的人乳腺癌MCF-7/MX细胞多药耐药的逆转作用

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中国药理学通报 2018年第6期34卷 862-866页

作者：付乃洁王畅朱迪颖刘临红张慧丰师锐赞张明升山西医科大学基础医学院药理学教研室山西太原030001

目的探讨黄芩素对乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRp)介导的人乳腺癌MCF-7/MX细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的逆转作用及可能机制。方法 MTT法检测黄芩素对MCF-7/MX细胞的增殖抑制及耐药逆转作用;West... 详细信息

目的探讨黄芩素对乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRp)介导的人乳腺癌MCF-7/MX细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的逆转作用及可能机制。方法 MTT法检测黄芩素对MCF-7/MX细胞的增殖抑制及耐药逆转作用;Western blot法检测黄芩素对MCF-7/MX细胞BCRp、p38 MApK、p-p38 MApK、核因子NF-κB p65蛋白表达的影响。结果 MCF-7/MX细胞对米托蒽醌、顺铂和氟尿嘧啶的耐药倍数分别为70.45、6.68、21.47。2.5、5μmol·L-1的黄芩素可增强MCF-7/MX细胞对上述化疗药的敏感性,下调BCRp表达,降低NF-κB p65蛋白表达和p38蛋白的磷酸化水平。结论黄芩素可有效逆转BCRp介导的MCF-7/MX细胞的MDR,此作用可能与抑制p38 MApK信号通路和NF-κB信号通路有关。

关键词：黄芩素多药耐药乳腺癌耐药蛋白米托蒽醌 p-p38 NF-κB

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苦参碱对Raji细胞凋亡的影响及其机制

中药材 2011年第4期34卷 576-579页

作者：刘占术罗章琴谢波薛乾富肖悦杨泽松陈建斌重庆医科大学附属永川医院血液内科重庆402160 重庆医科大学附属第一医院血液内科重庆400016

目的:探讨活化的p38MApK在苦参碱(Matrine,Mat)诱导人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞凋亡过程中对Fas/FasL的影响。方法:选用Raji细胞进行体外培养,用苦参碱(终浓度为0.4、0.8、1.6 mg/mL)和在此基础上加入SB203580(p38 MApK抑制剂)作用48 h... 详细信息

目的:探讨活化的p38MApK在苦参碱(Matrine,Mat)诱导人Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞凋亡过程中对Fas/FasL的影响。方法:选用Raji细胞进行体外培养,用苦参碱(终浓度为0.4、0.8、1.6 mg/mL)和在此基础上加入SB203580(p38 MApK抑制剂)作用48 h后,分别采用AnnexinⅤ-FITC/pI双染法检测细胞凋亡率和Western blot检测p-p38MApK、Fas、FasL蛋白表达的变化。结果:终浓度为0.4、0.8、1.6 mg/mL苦参碱对Raji细胞总凋亡率显著高于SB203580组及对照组(ppp-p38MApK、Fas、FasL蛋白表达水平随苦参碱浓度的提高而增加,并且在加入SB203580后降低。p-p38MApK与Fas、FasL具有明显相关性。结论:苦参碱可能通过活化p38MApK来上调Fas、FasL的表达,从而促进Raji细胞凋亡。

关键词：苦参碱 Raji细胞 p-p38 MApK Fas/FasL 凋亡

叶黄素对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制及其机制

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世界华人消化杂志 2013年第13期21卷 1239-1244页

作者：付蕾陈晓哲张慧娟张源渊王凌飞徐少博张玉杰王明臣郑州大学药学院河南省郑州市450000 郑州大学基础医学院生物化学教研室河南省郑州市450000

目的:研究叶黄素对结肠癌HT29细胞的增殖抑制作用及可能的机制.方法:用不同浓度的叶黄素(20、40、80、160 m g/L)和空白对照组(0 m g/L)干预处理培养的HT29细胞24、48、72 h,采用SRB法检测其对该细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞... 详细信息

目的:研究叶黄素对结肠癌HT29细胞的增殖抑制作用及可能的机制.方法:用不同浓度的叶黄素(20、40、80、160 m g/L)和空白对照组(0 m g/L)干预处理培养的HT29细胞24、48、72 h,采用SRB法检测其对该细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期;Hoechst33342/pI荧光染色法检测细胞凋亡;Western blot检测磷酸化ERK(phosphorylation of ERK,p-ERK)、磷酸化p38(phosphorylation of p38,p-p38)蛋白表达水平的变化.结果:叶黄素能抑制HT29细胞增殖,且有明显的剂量和时间依赖性.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,叶黄素(80 mg/L)干预处理HT29细胞48 h后,G0/G1期细胞由58.67%增加至63.23%,且随药物浓度增加,G0/G1期细胞显著增加,当叶黄素浓度为160 mg/L时,G0/G1期细胞增加至70.81%,表明叶黄素可将HT29细胞阻滞在G0/G1期;Hoechst33342/pI荧光染色法检测细胞凋亡结果显示,叶黄素可诱导HT29细胞凋亡;Western blot检测结果显示叶黄素可下调p-ERK、上调p-p38蛋白的表达,有浓度依赖性(pp-ERK蛋白、上调p-p38蛋白的表达可能是其诱导细胞凋亡的重要机制.

关键词：叶黄素结肠癌增殖 p-ERK p-p38